[发明专利]一种表达微菌素Y的枯草芽孢杆菌工程菌株及其制备和应用

说明书

本发明涉及一种表达微菌素Y的枯草芽孢杆菌工程菌株及其制备和应用，属于基因工程技术和生物技术领域，本发明首先将mcyA和mcyBCD的基因序列调整为相同方向，并且用SD和起始密码子序列相连获取mcyABCD改造基因，然后以PHT43作为载体，通过枯草芽孢杆菌对改造后的mcyABCD基因进行表达并成功表达MccY，其表达产物具有良好的鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的杀菌活性，为MccY在养殖业生产实践中的应用提供了更经济便捷的模式。

技术领域

本发明属于基因工程技术和生物技术领域，具体涉及mcyABCD基因序列的改造和采用枯草芽孢杆菌(食品级益生菌)作为表达系统，对MccY的抗菌活性研究。

背景技术

微菌素Y(MccY)是近期发现的一种来源于肠道菌的小分子抗菌肽，其生物合成需要四个基因参与，即mcyABCD，其中mcyA编码MccY的线性氨基酸前体，mcyB、mcyC和mcyD编码翻译后修饰蛋白，转运蛋白以及分泌和自身免疫相关蛋白。类似于微菌素J25(MccJ25)，MccY通过铁载体受体蛋白(FhuA)进入细菌，对细菌进行内部瓦解，进而杀死细菌，其主要针对鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和婴儿沙门氏菌等血清型以及部分志贺氏菌和大肠杆菌。

MccY的发现极大地扩展了现有微菌素的抑菌谱，尤其弥补了微菌素J25在抑制鼠伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌等常见致病菌能力方面的缺陷。相似的是，它们都由肠杆菌分泌产生并且被发现，由于菌自身表达系统限制性的影响，极少有人使用革兰氏阳性菌作为表达系统，对此展开研究。目前，MccY的分泌表达是以大肠杆菌BL21菌株作为表达菌株，并且展现了良好的杀菌活性，但是由于大肠杆菌内毒素的影响，对于MccY的纯化具有很高的的要求，限制了其在养殖业生产实际中的应用。而作为革兰氏阳性菌的枯草芽孢杆菌属于食品级益生菌，其表达的MccY在生产应用上具有更经济快捷的使用方法，可以避免内毒素的影响，简化纯化工艺，并且实现直接饲添和活菌肠道定殖等。由于微菌素的杀菌机理不同于抗生素，MccY有望在全面禁抗的行业背景下，成为一种新型药物制剂，而益生菌对于MccY的成功表达，开启了更经济便捷的生产模式。

发明内容

为了开发益生菌对微菌素Y的表达系统，本发明以PHT43作为载体，通过枯草芽孢杆菌对改造后的mcyABCD基因进行表达并成功表达MccY，其表达产物具有良好的鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的杀菌活性，为MccY在养殖业生产实践中的应用提供了更经济便捷的模式。

本发明的目的和采取的技术方案如下：

本发明的目的一在于提供用于在枯草芽孢杆菌中表达微菌素Y的多核苷酸，所述多核苷酸为mcyABCD改造基因或包含所述mcyABCD改造基因；所述mcyABCD改造基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示。

本发明的目的二在于提供一种包含上述多核苷酸的重组质粒。

优选地，所述重组质粒为PHT43-mcyABCD，是将mcyABCD改造基因插入到PHT43质粒中构建所得。

本发明的目的三在于提供一种工程菌，所述工程菌包含上述的重组质粒。

优选地，所述工程菌为枯草芽孢杆菌工程菌株，是将重组质粒PHT43-mcyABCD转入枯草芽孢杆菌中制备所得。

本发明的目的四在于提供一种药物制剂，包含所述的工程菌或/和所述工程菌表达分泌的微菌素Y。

本发明的目的五在于提供一种微菌素Y的枯草芽孢杆菌表达系统，该表达系统将重组质粒PHT43-mcyABCD转入枯草芽孢杆菌中，然后进行诱导表达。

本发明的目的六在于提供所述的枯草芽孢杆菌表达系统的构建方法，包括以下步骤：