[发明专利]一种RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高丰加霉素发酵产量的方法

说明书

本发明公开了一种RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高丰加霉素发酵产量的方法，通过过量表达淀粉酶产色链霉菌的RSH基因，获得丰加霉素高产菌株，用所获得的菌株发酵生产丰加霉素产量至少提高到3459.74mg/L，是原始菌株产量的21.43倍，为目前已报到的最高产量，为工业生产提高丰加霉素产量提供新的技术支持。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因工程菌株及其构建方法，尤其涉及一种通过改造淀粉酶产色链霉菌，过量表达淀粉酶产色链霉菌RSH基因提高丰加霉素产量的生产方法及应用。

背景技术

丰加霉素是一种核苷类抗生素，分子式为C₁₂H₁₃N₅O₄，核糖C1连接类似鸟嘌呤的脱氮杂嘌呤环，核心结果为吡咯嘧啶核苷类似物。作用机理主要是通过抑制微生物的转运而影响菌体的生长，可以广泛用于医疗、制药、农业等领域。近年来发现，丰加霉素可以用作农用抗生素，抑制多种植物病原真菌的生长，如黄瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌等。此外，丰加霉素由于是链霉菌的天然代谢产物，对环境污染小，对植物生长也有一定的调节作用，是一种理想的生物农药。相对于化学合成，生物法合成效率更高，反应条件温和，对环境污染小，生产成本低，是目前合成丰加霉素的主要技术手段。

丰加霉素是链霉菌的次级代谢产物，合成途径复杂，受到微生物内多种调控因子的调控，单一途径基因的调节无法大幅度提高产物的产量。目前丰加霉素的产量较低，还无法进行工业化生产。采用紫外诱变等方式可以提高次级代谢产物的产量，但是由于次级代谢产物筛选困难，需要大规模的筛选才能获得高产菌株。

通过过量表达淀粉酶产色链霉菌的RSH基因，该基因可以调节链霉菌严谨反应的发生，进而激活次级代谢途径，激活途径特异性转录调控因子的转录。研究表明，通过在营养匮乏条件下激活严谨反应，能够提高S.coelicolor A3(2)和棒状链霉菌的次级代谢产物产量。因此，过量表达淀粉酶产色链霉菌RSH基因可以提高次级代谢产物产量。

发明内容

本发明的目的是提供一种RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌及提高丰加霉素发酵产量的方法，其是通过过量表达淀粉酶产色链霉菌RSH基因，显著提高淀粉酶产色链霉菌胞内ppGpp合成，从而提高淀粉酶产色链霉菌的丰加霉素产量。

本发明首先提供了一种RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌，其为通过基因工程方法由质粒pIB139和RSH基因构建重组质粒，并转入淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes 1628)中构建得到，所述RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌过量表达RSH基因，所述RSH基因序列如SEQ ID No.1所示。所述的RSH基因来自于淀粉酶产色链霉菌。所述的RSH基因能够激活淀粉酶产色链霉菌的严谨反应，进而正向调控丰加霉素合成。

所述淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes 1628)在CN201410128610.X、CN201410128645.3中已经公开，其已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCC No.2060.

本发明还提供了一种上述的RSH过表达基因工程淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其包括如下步骤：

1)以淀粉酶产色链霉菌为模板，PCR扩增获得含有NdeI和XbaI两个酶切位点的RSH基因；

2)用NdeI和XbaI双酶切质粒pIB139，将扩增的目的基因片段用NdeI和XbaI双酶切后，与双酶切质粒pIB139进行连接；得到重组穿梭载体pIB139-RSH；转入大肠杆菌感受态细胞，筛选转化子保存；所述质粒pIB139是在pSET152质粒上，在多克隆位点添加红霉素启动子PermE*或者其他链霉菌内可用启动子构建获得；重组穿梭载体pIB139-RSH为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒；