[发明专利]一种单抗克隆与表达载体的构建及应用

说明书

本发明为一种单抗克隆与表达载体的构建及应用，属于分子克隆技术领域。构建时将抗体leader序列插入pCDNA3.1‑myc‑His载体HindIII和EcoRI酶切位点，将抗体C_H、C_k和C_λ序列分别插入重组载体XhoI和Agel酶切位点，获得单抗克隆与表达载体。应用时，以单抗克隆与表达载体为模板PCR扩增获得载体线性DNA，与抗体可变区基因混合作为模板，PCR扩增获得抗体线性表达盒；筛选高活性抗体后，将载体线性DNA与抗体可变区基因无缝连接构建抗体质粒表达载体，表达抗体。本发明与现有技术相比省去1个载体构建、2个PCR反应、2个双酶切、3个DNA纯化，提高了抗体基因克隆与表达的效率。

技术领域：

本发明属于分子克隆技术领域，具体涉及一种单抗克隆与表达载体的构建及应用。

背景技术：

单克隆抗体(单抗)药物在抗病原感染和肿瘤治疗领域广泛应用，单克隆抗体的制备技术包括杂交瘤技术、噬菌体抗体库技术和基于单个B细胞的抗体基因克隆技术等。基于单个B细胞的抗体基因克隆、表达与筛选技术日益受到重视并在单克隆抗体药物研制领域广泛应用。

抗体分子由重链(H链)和轻链(K链或λ链)构成，重链和轻链分为可变区(V)和恒定区(C)两部分。可变区具有抗原特异性，与抗原结合，因此在抗体基因克隆时，通常只扩增可变区V片段，然后和恒定区DNA片段连接。目前文献报道的基于单个B细胞抗体基因克隆的方案是(以抗体重链克隆为例)，①分别构建C片段、H片段重组T载体，即合成CMV启动子与抗体leader序列基因并克隆到T载体上，称为C片段；合成抗体恒定区基因和牛生长激素PolyA信号序列克隆到另一个T载体上，称为H片段；②利用抗体可变区引物扩增可变区基因序列，即V片段，V片段N端与C片段C端、V片段C端与H片段N端有大约20bp的重复序列；③构建线性表达盒，分别用PCR扩增T载体的C片段和H片段，纯化后将C片段、H片段与V片段DNA混合，利用重叠PCR将三个片段连接，形成完整抗体基因的线性表达盒。纯化后，将线性表达盒转染哺乳动物细胞，表达抗体，检测抗体的活性。④当筛选到高活性抗体时，再用引物以线性表达盒为模版扩增抗体全长基因，克隆至真核表达载体，表达单克隆抗体。

现有技术在构建表达盒时需要分别扩增和纯化C片段和H片段，获得活性抗体后，需要以线性表达盒为模板扩增全长抗体基因，再克隆至真核表达载体，以表达抗体。现有技术存在实验操作繁琐、效率低等缺点。

发明内容：

本发明的目的是克服上述现有技术存在的不足，提供一种单抗克隆与表达载体的构建及应用，使得基于单个B细胞的抗体基因克隆与表达更简化、更高效，该克隆与表达载体的构建更加优化、简便与高效，减少PCR扩增、酶切、纯化等实验操作步骤，提高克隆、表达效率。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种单抗克隆与表达载体的构建，包括以下步骤：

(1)将leader序列插入pCDNA3.1-myc-His载体的HindIII和EcoRI酶切位点，与pCDNA3.1-myc-His载体的CMV启动子序列构成C片段，无需合成CMV序列，重组载体命名为pCDNA-C；

(2)将抗体重链恒定区基因序列(C_H)、轻链k链恒定区DNA序列(C_k)和轻链λ链的恒定区DNA序列(C_λ)，分别插入pCDNA-C重组载体的XhoI和Agel酶切位点，与pCDNA3.1-myc-His载体的牛生长激素PolyA信号序列分别构成H片段、K片段和L片段，无需合成牛生长激素PolyA信号序列，完成构建，获得重组载体，分别命名为pCDNA-C-H、pCDNA-C-K和pCDNA-C-L，即为单抗克隆与表达载体，重组载体分别含有C片段和H片段、C片段和K片段、C片段和L片段。

所述的步骤(1)中，leader序列为：