[发明专利]一种快速获取大鲵原代性腺细胞的方法

说明书

本发明公开了一种快速获取大鲵原代性腺细胞的方法，包括如下步骤：(1)麻醉后处死大鲵，大鲵体表消毒，取出性腺组织放置于双抗PBS溶液中备用；(2)用PBS溶液冲洗性腺至缓冲液清澈无明显浑浊，用完全培养基冲洗性腺；(3)将性腺剪碎，吸取剪碎的组织块于细胞筛上，研磨性腺组织块使其通过细胞筛成为单细胞。通过细胞网筛的方式直接获取性腺细胞单细胞，避免了由于传代培养导致细胞发生形态异质，从而引起实验数据产生偏差，建立了一种原代大鲵性腺单细胞获取方式以及处理方法，解决了目前缺少相应大鲵细胞系无法进行细胞水平实验的问题，也为后续大鲵性别控制和后续活体水平实验奠定基础。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种快速获取大鲵原代性腺细胞的方法。

背景技术

中国大鲵(Andrias davidianus)别名“娃娃鱼”、“人鱼”、“孩儿鱼”、“狗鱼”、“脚鱼”等，隶属脊索动物门(Chordata)，脊椎动物亚门(Vertebrata)，两栖纲(Amphibia)，有尾目(Urodela)，隐鳃鲵科(Cryptobranchidae)，大鲵属(Andrias)，为我国特有大型两栖物种。中国野生大鲵分布广泛，主要分布于我国中部地区，包括长江流域、黄河流域及珠江中上游地区。中国大鲵肉质细腻、口感独特、食味鲜美，同时兼具食用与药用价值，是具有较高的经济效益的经济动物。据《本草纲目》记载，大鲵可增食欲、补气血、养身心，对癫痫、痢疾、贫血、霍乱等均有一定的治疗效果，在《本草经集注》、《本草拾遗》等药典中也有能“治痴疾、治牛、治斑疾”的描述。目前大鲵产业在保健以及医疗等方面都有涉及。

二十世纪八十年代，由于过度捕杀，栖息地碎片化以及环境污染等因素的影响，野生大鲵种群数量锐减，几近灭绝。自二十世纪九十年代开始，由于对于大鲵人工繁殖技术的突破以及国家对于大鲵保护工作的支持，大鲵人工养殖技术迅速发展，大鲵养殖产业迅速兴起并快速发展。近年来，随着大鲵人工繁殖技术的不断成熟与完善，大鲵养殖成为中国特种水产养殖业的重点。陕西、重庆、浙江、湖南、湖北、广东和广西等地区，大鲵养殖业发展尤为迅速。

要做好大鲵的人工繁育工作，亲本培育是所有环节中的重中之重，因此，如何区别大鲵亲本性别进行针对性培养显得尤为重要。

原代细胞(primary culture cell)是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养，是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质。原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体叫做细胞系(cell line)。细胞培养很好的补充了体内实验的不足，它让细胞功能和进程的研究更具可操作性。细胞系的一个缺点是它们往往与原始的组织有不一样的遗传和表型。相比之下，原代细胞保持了细胞在体内的许多重要标志和功能。最早开始进行两栖动物细胞系建立的是WOLF在1964年进行的牛蛙FT细胞系(WOLF et al.1964)。目前大鲵所具有的细胞系有大鲵胸腺细胞系、大鲵脾细胞系和大鲵肾细胞系(Yuan et al.2015)等。值得注意的是Yuan在实验相应组织的原代细胞在一个月后从组织中移出并且在形态上是异质的，后续还需要长达60次的传代才建立相应细胞系。因此对于未建立细胞系的相关组织如何进行细胞水平的处理对于后续进行大鲵性别调控的相关研究显得十分重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种快速获取大鲵原代性腺细胞的方法。

本发明的技术方案为：一种快速获取大鲵原代性腺细胞的方法，包括如下步骤：

(1)麻醉后处死大鲵，大鲵体表消毒，取出性腺组织放置于双抗PBS溶液中备用；

(2)用双抗PBS溶液冲洗性腺至缓冲液清澈无明显浑浊，用完全培养基冲洗性腺；

(3)将性腺剪碎，吸取剪碎的组织块于细胞筛上，研磨性腺组织块使其通过细胞筛成为单细胞，使用完全培养基将单细胞冲洗下来即得原代性腺细胞。

进一步地，所述双抗PBS溶液为含10％双抗的PBS溶液。