[发明专利]rAAV重组包装质粒、用于rAAV包装的质粒系统和rAAV的制备方法

权利要求书

1.一种rAAV的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：用质粒产品转染包装细胞，培养，收集rAAV；

所述质粒产品包括：含两个末端反向重复序列的质粒、腺病毒辅助质粒和rAAV重组包装质粒；

所述rAAV重组包装质粒包含pAAV-RC质粒，以及插入所述pAAV-RC质粒的P5启动子、真核启动子和mir342基因，所述P5启动子位于所述pAAV-RC质粒所含rep基因的上游，用于调控rep基因的表达，所述真核启动子位于所述mir342基因的上游，用于调控所述mir342基因的表达。

2.根据权利要求1所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述P5启动子位于所述pAAV-RC质粒第1个碱基至第481个碱基之间或者第7004个碱基至第7350碱基之间。

3.根据权利要求1所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述真核启动子为CMV、EF1a、CAG或者SV40。

4.根据权利要求1至3任一项所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述rAAV重组包装质粒的构建方法包括在pAAV-RC质粒中插入所述P5启动子、所述真核启动子和所述mir342基因的步骤。

5.根据权利要求4所述的rAAV的制备方法，其特征在于，在所述pAAV-RC质粒中插入所述P5启动子、所述真核启动子和所述mir342基因的步骤包括：

用Hpa I酶和Eag I酶酶切所述pAAV-RC质粒，制备酶切产物Ⅰ；

在所述P5启动子的两端添加Hpa I酶和Eag I酶的酶切位点片段，用Hpa I酶和Eag I酶进行双酶切，制备酶切产物Ⅱ；

用连接酶连接所述酶切产物Ⅰ和所述酶切产物Ⅱ，制备重组质粒pAAV-P5-RC；

用Xma I酶和SnaB I酶双酶切所述pAAV-P5-RC，制备酶切产物Ⅲ；

提供包含所述真核启动子和所述mir342基因的连接片段，在所述连接片段的两端添加Xma I酶和SnaB I酶的酶切位点片段，用Xma I酶和SnaB I酶进行双酶切，制备酶切产物Ⅳ；

用连接酶连接所述酶切产物Ⅲ和所述酶切产物Ⅳ，制备所述rAAV重组包装质粒。

6.根据权利要求5所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述Hpa I酶的酶切位点片段添加在所述P5启动子的5’端，所述Eag I酶的酶切位点片段添加在所述P5启动子的3’端。

7.根据权利要求5所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述Xma I酶的酶切位点片段添加在所述连接片段的3’端，所述SnaB I酶的酶切位点片段添加在所述连接片段的5’端。

8.根据权利要求1至3以及5至7任一项所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述含两个末端反向重复序列的质粒为pAAV-MCS质粒。

9.根据权利要求1至3以及5至7任一项所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述含两个末端反向重复序列的质粒还包含GOI。

10.根据权利要求1至3以及5至7任一项所述的rAAV的制备方法，其特征在于，所述包装细胞选自HEK293、HEK293T和HEK293F、HEK293A、Hela、Vero和CHO中的一种或者多种；或/和，培养的条件包括：CO₂含量为4.5%-5.5%（v/v）的气体环境，温度为36.5℃-37.5℃，时间为48小时-96小时。