[发明专利]rAAV重组包装质粒、用于rAAV包装的质粒系统和rAAV的制备方法

说明书

本发明提供一种rAAV重组包装质粒、用于rAAV包装的质粒系统和rAAV的制备方法。rAAV重组包装质粒包含pAAV‑RC质粒，以及插入所述pAAV‑RC质粒的P5启动子、真核启动子和mir342基因；P5启动子位于pAAV‑RC质粒rep基因上游，用于调控rep基因的表达；真核启动子位于mir342基因的上游，用于调控mir342基因的表达。本发明通过在pAAV‑RC质粒中插入mir342基因及调控其表达的真核启动子，并同时在其所含rep基因的上游引入P5启动子用于调控rep基因表达，从而构建得到一种rAAV重组包装质粒，采用包含该rAAV重组包装质粒的三质粒产品包装病毒，能够有效提升病毒滴度，提高产生效率，降低生产成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种rAAV重组包装质粒、用于rAAV包装的质粒系统和rAAV的制备方法。

背景技术

腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（parvoviridae）家族的成员之一，是一类无法自主复制、无被膜的二十面体微小病毒，其直径约20-26nm，含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。

研究中采用的重组腺相关病毒载体（recombination adeno-associated virus,rAAV）是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广（对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力）、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途、哺乳动物最安全的基因研究和基因治疗载体之一。

传统的rAAV制备主要采用三质粒包装病毒法，即采用三质粒共转染包装细胞进行rAAV制备，三质粒包括：含目的基因的pAAV-GOI质粒，提供rep基因、cap基因的pAAV-RC质粒，以及提供E2、E4、VA蛋白基因的pAAV-Ad质粒（也即腺病毒辅助质粒）。传统的三质粒包装病毒法例如CN112888426A公开的病毒包装方法，该包装方法涉及用于重组腺相关病毒载体rAAV产生的质粒系统，其包括：（i）含转基因质粒，其包括由5 ‘和3 ‘AAV反向末端重复序列ITR侧接的至少一种异源核酸和在所述ITR外部的填充序列；（ii）质粒，其包括AAV复制(Rep)和衣壳(Cap)基因序列；和（iii）腺病毒(Ad)辅助质粒。传统的三质粒包装病毒法再例如于水澜、姜颖等发表的“携带人肝癌细胞CDK2基因的rAAV载体的构建与鉴定”提到的：设计能表达CDK2特异性的小干扰RNA（siRNA），构建pAKD-shRNA-CDK2重组质粒，采用磷酸钙共转染法将pAKD-shRNA-CDK2重组质粒、包装质粒pAVV-RC和辅助质粒pHelper共转染AVV-293细胞。然而，采用传统的三质粒包装病毒法，所得病毒滴度较低。

发明内容

基于此，本发明的主要目的是提供一种rAAV重组包装质粒，用其以及含两个末端反向重复序列的质粒和腺病毒辅助质粒包装生产rAAV，能有效提高病毒滴度。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种rAAV重组包装质粒，所述rAAV重组包装质粒包含pAAV-RC质粒，以及插入所述pAAV-RC质粒的P5启动子、真核启动子和mir342基因；

所述P5启动子位于所述pAAV-RC质粒所含rep基因的上游，用于调控rep基因的表达；

所述真核启动子位于所述mir342基因的上游，用于调控所述mir342基因的表达。

在其中一些实施例中，所述P5启动子位于所述pAAV-RC质粒第1个碱基至第481个碱基之间或者第7004个碱基至第7350个碱基之间。

在其中一些实施例中，所述真核启动子为CMV、EF1a、CAG或者SV40。

一种rAAV重组包装质粒的构建方法，所述构建方法包括在pAAV-RC质粒中插入所述P5启动子、所述真核启动子和所述mir342基因的步骤。