[发明专利]脱鳞病毒检测体系、引物、探针及方法

说明书

本发明提供了脱鳞病毒检测体系、引物、探针及方法。所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述脱鳞病毒检测体系包括所述引物和/或探针。所述脱鳞病毒检测方法采用微滴式数字PCR检测方法，即采集待测鱼类的组织样本后，提取样本的DNA，然后以DNA为模板采用微滴式数字PCR，可准确检测出待测鱼类是否感染或携带SDDV，本发明的微滴式数字PCR检测方法灵敏度高，在养殖鱼类优质亲本选择中具有较好的应用前景。

技术领域

本发明涉及水生动物病毒检测技术领域，特别涉及脱鳞病毒检测体系、引物、探针及方法。

背景技术

脱鳞病毒(Scale drop disease Virus,SDDV)是一种新生鱼虹彩病毒。早在2002年，马来西亚养殖金目鲈出现脱鳞症(Scale drop syndrome,SDS)病害。2012年，新加坡研究人员首次自SDS金目鲈观察虹彩病毒样病毒颗粒，但抗RSIV的单克隆抗体不能识别该病毒，提出该病毒可能是一种有别于RSIV的新型鱼虹彩病毒。2015年，MSD Animal Health的研究人员自新加坡的SDS金目鲈通过细胞培养途径培养出该病毒，命名为脱鳞病病毒(SDDV)。

黄鳍鲷具有极高的养殖价值，但近年来黄鳍鲷主养区在夏季高温季频繁出现黄鳍鲷腹水症状，发病鱼规格10～140g不等，临床症状主要表现为腹部肿胀，有时也伴有眼球脱落，解剖可见大量黄色腹水。当地养殖户将该病称为“黄鳍鲷腹水病”。

国内多个研究团队对该病害进行了跟踪研究，但一直没有可信结论。2020年6月初，珠海市现代农业发展中心与中山大学团队合作，最终通过细胞培养方法分离到SDDV样病毒。对该病毒系统的全基因组、全蛋白质组、细胞感染病理、透射电镜观察、回归感染、临床病例、组织病理及与ISKNV的抗原交叉反应研究，大量充分的研究证据显示SDDV是黄鳍鲷腹水病的病毒性病原。

目前对SDDV病毒的检测技术较少，基本存在于对国外地区的套式PCR和荧光定量PCR。但这些检测方法的灵敏度有限，在拷贝数较少的情况下很难被检测到，较容易出现假阴性。因此，有必要开发一种灵敏度高的SDDV检测方法。

发明内容

本发明目的在于提供脱鳞病毒检测体系、引物、探针及方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。

本发明的第一方面在于提供一对引物的核苷酸序列。所述引物为用于特异性扩增脱鳞病毒的上游引物57-F和下游引物57-R，

上游引物57-F：5’-GCACTAATGATAATGCAATTTCTGTAC-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物57-R：5’-TCACGCTCTTCGTTGGTCAG-3’(SEQ ID NO.2)。

本发明的第二方面在于提供一段探针的核苷酸序列。所述探针为用于特异性检测脱鳞病毒的探针57-P，

探针57-P：5’-CACCCGCTCTGACTGAAGTTAGTGTTATG-3’(SEQ ID NO.3)。探针的5’端带有荧光报告基团，如FAM、VIC、HEX、ROX、JOE、Cy3、Cy5等；3’端带有荧光猝灭基团，如TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3等。

所述引物及所述探针均以SDDV的主要衣壳蛋白(MCP)基因序列为靶标。

本发明的第三方面在于提供一种脱鳞病毒检测体系。所述脱鳞病毒检测体系包括ddPCR探针法预混液，所述ddPCR探针法预混液包括前述的引物和/或前述的探针。建立的检测体系基于微滴式数字PCR检测方法。该检测体系灵敏度较高，且未存在以该检测体系检测SDDV的现有技术。