[发明专利]一种重组结核分枝杆菌融合蛋白及其在结核诊断中应用

说明书

本发明公开一种重组结核分枝杆菌融合蛋白及其在结核诊断中应用。本发明所述的重组结核分枝杆菌融合蛋白用于结核病的体内诊断时，该蛋白具有较高敏感性、特异性和安全性。该融合蛋白还可以用于基于γ干扰素释放实验的体外诊断试剂盒。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组结核分枝杆菌融合蛋白及其在结核诊断中应用。

背景技术

结核病是慢性传染性疾病。目前全球已有20亿人感染结核菌，活动性结核患者达1500万，每年新发结核患者达800万～1000万，有180万人因结核病死亡。

传统的结核诊断手段包括影像学、细菌学、临床表现、分子生物技术等许多方面，其中经典的结核菌素试验已经应用了100年，但是该方法特异性差，不能鉴别卡介苗接种者，血清结核抗体检测等方法的敏感性和特异性不理想；近几年兴起的γ干扰素释放试验的试剂昂贵，技术复杂，需要特殊的设备和培训，不适合基层医疗单位或者现场应用。TB-PPD目前已经成为临床上最常用且最简便的一种结核菌感染诊断方法，反应越强，表示结核感染可能性越大。但是TB-PPD 不能区分卡介苗(BCG)接种或是结核杆菌感染，假阳性的结果影响结核病筛查。因此，临床急需一种适合基层医疗单位的皮肤诊断试剂。来源于致病性结核杆菌的ESAT-6和CFP-10两个抗原，在所有的BCG疫苗株中缺失，使得ESAT-6和 CFP-10有望成为新一代诊断试剂的核心抗原，人群中特异性可以达到93％，远高于TB-PPD的7％^[1]。可用于结核菌潜伏感染人群的筛查以及结核病的辅助诊断，克服了通用的特异性γ-IFN检测方法价格昂贵、设备及操作人员要求高的缺点，使用方便、易于推广、适合于大规模普及。但是目前的重组结核ESAT-6和 CFP-10分枝杆菌融合蛋白特异性和敏感性均有待提高。

发明内容

本发明涉及一种重组结核分枝杆菌融合蛋白及其在结核诊断中应用，本发明所述的重组结核分枝杆菌融合蛋白用于结核病的体内诊断时，该蛋白具有较高敏感性、特异性和安全性。该融合蛋白还可以用于基于γ干扰素释放实验的体外诊断试剂盒。

本发明所述的重组结核分枝杆菌融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供编码所述重组结核分枝杆菌融合蛋白的核苷酸序列。所述的核酸序列可以按照本领域常规的方法进行设计，在一些实施例中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的融合蛋白可以人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

在一种具体的实施方式中，本发明还提供所述重组结核分枝杆菌融合蛋白的一种具体的获得方法：将本发明所述的重组融合蛋白的编码基因序列插入原核表达载体，转入菌株扩增和纯化。

本发明还提供一种重组结核分枝杆菌融合蛋白的纯化方法，扩增和纯化后的菌体采用超声或高压均质机破碎菌体后，pH＝7.8～8.2的Tris-HCl作为蛋白溶液体系进行超滤；超滤结束后进行阴离子层析，5％～10％的NaCl去除杂蛋白， 10％～15％的NaCl收集目的蛋白。

本发明还提供一种结核体内诊断试剂，所述诊断试剂中含有本发明所述的重组结核分枝杆菌融合蛋白。

本发明还进一步提供一种基于γ干扰素释放实验的结核体外诊断试剂盒，所述体外诊断试剂盒中含有本发明所述的重组结核分枝杆菌融合蛋白。

本发明所述的重组结核分枝杆菌融合蛋白相对于现有技术，具有如下优势：

①特异性和敏感性相对于现有融合蛋白有显著提高。

②安全性显著提高。

③经过工艺优化之后，本发明所提供的融合蛋白纯化方法仅包含菌体破碎、超滤和离子层析3个步骤，简化了生产工艺，更有利于工业化生产。

附图说明

图1重组蛋白电泳图谱。