[发明专利]一种高产麦角硫因的基因工程菌

说明书

本发明公开了一种高产麦角硫因的基因工程菌，属于基因工程领域。本发明提供的重组菌BWEGT‑12的麦角硫因合成产量在72h达到最高，产量为110mg/L。本发明首先筛选了来源不同的麦角硫因合成基因簇，筛选了来源于黑根霉菌和耐辐射红色杆菌的麦角硫因合成基因，初步实现了65mg/L和77mg/L麦角硫因产量。进一步的，本发明对底盘细胞进行改进，分别针对组氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢途径中的相关基因进行增强表达或敲除，实现了81mg/L麦角硫因产量。为了达到更高的产量，本发明有针对性蛋氨酸循环和叶酸循环全途径中的基因进行调整，最终实现了110mg/L的麦角硫因产量。本发明在大肠杆菌中实现了麦角硫因的高效合成，有助于拓展麦角硫因的市场供应量。

技术领域

本发明涉及一种高产麦角硫因的基因工程菌，属于基因工程领域。

背景技术

麦角硫因(ergothioneine)是一种含有硫的氨基酸衍生物，它是一种独特的细胞生理保护剂，广泛存在于人体血液、精液、肝肾等组织中，具很强的抗氧化、抗衰老、抗辐射活性，具有维持DNA合成和细胞正常的生长代谢及多种生理功能，被视为一种维持人体健康所必须的功能活性物质。但人体自身并不能合成麦角硫因，需要从其他合成麦角硫因的食物如蘑菇中获取，并通过一种新型的阳离子转运体(OCTN1)聚集于人体多数细胞和组织。随着年龄的增加，人体内血液中麦角硫因浓度会随之下降，有研究结果表明机体中麦角硫的缺乏会造成与年龄相关的疾病，如虚弱疲劳、心脑血管疾病、神经退行性疾病和慢性炎症性疾病等。同时动物及人体实验表明高剂量的麦角硫因对机体无毒副作用，麦角硫因性能稳定，在生理PH值下和强碱溶液中不会自身氧化。

麦角硫因因其出色的抗氧化能力被广泛应用于化妆品领域。2017年7月13日，欧盟委员会授权将L-麦角硫因(L-ergothioneine)作为新食品成分投放市场。

同年冬，欧洲食品安全局(EFSA)发布文件，认可合成L-麦角硫因作为一种用于婴幼儿、孕妇和哺乳期妇女膳食的新资源食品是安全的。目前为止麦角硫因的主要生产方式仍为植物提取，其产能偏低导致麦角硫因价格居高不下，严重阻碍了麦角硫因的市场开发推广。在本研究中，整合真菌来源的麦角硫因合成途径到大肠杆菌中实现了麦角硫因的高效合成，有助于拓展麦角硫因的市场供应量。

发明内容

麦角硫因在细菌，真菌和厌氧菌内分别具有不同的合成途径，目前解析最清晰为原核生物中五基因合成途径及真核生物中二基因合成途径，而厌氧合成途径报道较少；本项目选取了合成途径更为简短的真菌来源麦角硫因合成基因簇在大肠杆菌中重构了麦角硫因合成途径。

本发明第一个目的是提供一种重组菌，所述重组菌游离表达麦角硫因合成基因组合(a)或(b)；其中，(a)为RsEGT1和RsEGT2，(b)为RrEgtB和RrEgtC。

在本发明的一种实施方式中，所述RsEGT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示和RsEGT2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2。

在本发明的一种实施方式中，所述RrEgtB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述RrEgtC的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌BW25113为出发菌株，增强基因组上HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的表达，抑制或降低基因组上YhaM，tnaA，TolC，metJ，mgl，YjeH，YeaS的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述增强为将HisA，HisF，cysE，NrdH，cysP，metH，mtn，lux，metK，metF的启动子替换为强启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述强启动子包括J23100启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。