[发明专利]一种非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法、试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法，其是以ASFV非结构蛋白B602L抗原作为目的基因，以pColdⅠ质粒作为载体，成功构建重组质粒pColdⅠ-B602L，通过原核表达系统获得了上清表达的重组pB602L蛋白，并对大量表达的目的蛋白进行纯化；以纯化的pB602L蛋白作为包被抗原，建立了猪ASFV间接ELISA抗体检测方法。

2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在于，所述的重组质粒pColdⅠ-B602L的构建过程包括如下步骤：

(1)根据ASFV-SY18毒株B602L基因设计特异性扩增引物进行扩增，在序列3'端末尾加入6个组氨酸标签，其中正向引物如SEQ.No.1所示，反向引物如SEQ.No.2所示；其中PCR扩增反应体系的组成为：2×LATaq PCR Master Mix，25μL，Forward Primer(10μM)2μL，ReversePrimer(10μM)2μL，质粒模板2μL，使用ddH₂O补充至50μL；其中所述的PCR反应程序为：95℃保温5min，PCR扩增30个循环，其中每一循环的温度控制依次为95℃，30s；60℃，30s；72℃按照扩增速度为1min/kb扩增7min，退火至4℃终止扩增反应；

(2)将原核表达载体pColdⅠ空载体使用EcoRⅠ和XbaⅠ进行双酶切，将酶切反应体系加入灭菌EP管中，置37℃水浴锅中水浴3h，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，胶回收试剂盒回收与预期相符目的片段，得到pColdⅠ酶切产物，其中酶切反应体系如下：表达载体pColdⅠ 1μg，EcoRⅠ酶1μL，XbalⅠ酶1μL，10×Cut Smart Buffer 5μL，使用ddH₂O补充至50μL；

(3)将鉴定正确的胶回收产物目的基因B602L和表达载体pColdⅠ使用同源重组试剂盒进行连接，构建pColdⅠ原核表达载体，连接反应体系如下：pColdⅠ酶切产物30ng，ASFVB602L 120ng，2×Hieff Clone Enzyme Premix 10μL，使用ddH₂O补充至20μL；将连接反应体系置于50℃水浴锅中，反应50min，反应结束后立即置于冰上3min或于-20℃保存，得到同源重组连接产物；

(4)将同源重组连接产物转化至DH5α感受态细胞，振荡培养后将菌液涂布于氨苄抗性的LB平皿，置于37℃恒温细菌培养箱中，倒置过夜培养，挑取单克隆菌落，置于LB培养基中进行菌落PCR鉴定，其反应体系如下：2×LATaq PCR Master Mix 10μL，菌液5μL，ForwardPrimer(10μM)0.5μL，Reverse Primer(10μM)0.5μL，ddH₂O 4μL；

反应程序如下：

(5)PCR反应结束后使用1％的琼脂糖核酸胶进行电泳，将目的条带的单克隆菌落，接种于含有氨苄抗性的LB培养基中，振荡培养后按照小提质粒DNA试剂盒步骤提取质粒，测序并确定质粒浓度后保存-20℃，命名为pCold-B602L质粒。

3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在于，所述的原核表达系统表达重组pB602L蛋白过程包括如下步骤：将测序正确的pCold-B602L质粒转化至BL21感受态细胞中，倒置过夜培养，37℃200rpm恒温震荡至菌液OD值0.6-0.8时，加入0.5mM IPTG，16℃恒温诱导表达pB602L蛋白。

4.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法，其特征在于，所述的重组pB602L蛋白的纯化过程包括如下步骤：将诱导表达pB602L蛋白后的菌液离心，使用PBS洗涤，使用预冷的裂解液重悬菌体沉淀，置于冰上，超声裂解30min至菌体悬液变得澄清，超声裂解菌体后在4℃，8000rpm离心30min，收获蛋白上清，选用Ni²⁺亲和层析纯化重组蛋白。