[发明专利]来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂

权利要求书

1.一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1.将肿瘤组织进行清洗、分割，放入消化液中震荡消化30-40min；

S2.组织消化后过滤、洗涤、离心，用T淋巴细胞完全培养基重悬沉淀后加入到预先包被的培养瓶中，补加IFN-γ至终浓度1000-1500IU/ml，进行细胞培养；所述包被的培养瓶的方法为：用含有CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基包被培养瓶置于37℃，5.0% CO₂条件下0.5-1h；

S3.每日观察细胞状态，取样计数，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在0.5-0.8×10⁹/L，继续细胞培养；

S4.继续每日观察细胞状态，当培养体系达到10-15ml时，取样计数，将细胞转移至预先包被的培养瓶中，包被方法同步骤S2；根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在0.5-0.8×10⁹/L，补加IFN-γ至终浓度1000-1500IU/ml，继续细胞培养；

S5.继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到25-45ml时，将细胞转入另一培养瓶中，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在0.5-0.8×10⁹/L，继续细胞培养；

S6.继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到180-200ml时，将细胞转入细胞培养袋中，按照20-50ng/ml向培养袋中补加CD3和CD28单抗，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在0.5-0.8×10⁹/L，继续细胞培养；

S7.继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到1600-2000ml且细胞总数在4×10⁹以上时，收获全部细胞。

2.根据权利要求1所述的一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于：步骤S1中，每立方厘米组织块加入10-15ml消化液。

3.根据权利要求1所述的一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于：步骤S1中，消化液为含有0.075-0.15g/ml的Ⅰ型胶原酶的1640培养基。

4.根据权利要求1所述的一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于：T淋巴细胞完全培养基为含有10-20 v%胎牛血清、2 v% 50X必需氨基酸和4000-6000IU/ml IL-2的X-VIVO 15培养基。

5.根据权利要求1所述的一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于：步骤S2中，CD3和CD28两种单抗的含量为20-50ng/cm²。

6.一种权利要求1-5任一所述制备方法制备得到的来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞。

7.一种肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞制剂，其特征在于：包括权利要求6所述的来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞。