[发明专利]来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂

说明书

本发明公开了一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂。本发明通过对肿瘤组织进行消化分离，获得的种子细胞，给予连续刺激并使用特定培养基进行扩增培养，在较短培养周期内即可获得满足制剂需求的细胞数量并制成细胞悬液。本发明采用连续刺激加定向培养的扩增方式，在细胞接种初始即给予刺激，相比传统培养方法先扩增种子细胞数再刺激的方式，可大大提高细胞扩增效率，缩短培养周期，使细胞维持高水平的生物活性。

技术领域

本发明涉及T淋巴细胞制剂领域，特别涉及一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂。

背景技术

近几年，随着生物医药领域的迅猛发展，免疫疗法逐渐成为继手术、放疗、化疗后第四类肿瘤治疗手段，其中过继性细胞治疗、免疫检查点阻断疗法、肿瘤疫苗以及双特异性抗体等治疗方法均取得了一定的临床疗效。然而在实体瘤发展过程中，实体肿瘤的物理屏障及其复杂的肿瘤微环境限制了非特异性免疫治疗的疗效。

来自肿瘤内部或肿瘤组织附近的肿瘤组织浸润性淋巴细胞，对肿瘤细胞具有特异性识别能力，在1922年首次被提到，Mac carty推测淋巴细胞到肿瘤组织内是体内免疫系统抵抗肿瘤的一种现象，提出了肿瘤组织浸润性淋巴细胞是一种高效抗癌的免疫效应细胞。1986年Rosenberg等人在荷瘤小鼠的肿瘤组织内发现并分离出了肿瘤组织浸润性淋巴细胞，他们将分离出的细胞经过体外扩增培养后，再回输到荷瘤小鼠体内，发现肿瘤组织有明显消退，从而证明肿瘤组织浸润性淋巴细胞具有抗肿瘤的作用。

常规的肿瘤特异性杀伤T淋巴细胞培养方法，多采用两步法进行培养，先用高浓度的IL-2扩增细胞数量，再用CD3单抗、CD28单抗或辐照的人外周血PBMC等对细胞进行刺激以提高效应细胞的比例，培养周期通常在20-25天，也有研究培养到36天，此方法最后收获的细胞，往往生物活性均有所降低，并且最终制剂中含有较高比例的调节性T淋巴细胞，严重影响临床治疗效果。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供了一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂。

第一方面，本发明提供一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备方法，是通过以下技术方案得以实现的。

一种来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的T淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1.将肿瘤组织进行清洗、分割，放入消化液中震荡消化30-40min；

S2.组织消化后过滤、洗涤、离心，用T淋巴细胞完全培养基重悬沉淀后加入到预先包被的培养瓶中，补加IFN-γ至终浓度1000-1500IU/ml，进行细胞培养；所述包被的培养瓶的方法为：用含有CD3和CD28单抗的T淋巴细胞完全培养基包被培养瓶置于37℃，5.0% CO₂条件下0.5-1h；

S3.每日观察细胞状态，取样计数，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在0.5-0.8×10⁹/L，继续细胞培养；

S4.继续每日观察细胞状态，当培养体系达到10-15ml时，取样计数，将细胞转移至预先包被的培养瓶中，包被方法同步骤S2；根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在0.5-0.8×10⁹/L，补加IFN-γ至终浓度1000-1500IU/ml，继续细胞培养；

S5.继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到25-45ml时，将细胞转入另一培养瓶中，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在0.5-0.8×10⁹/L，继续细胞培养；

S6.继续每日观察细胞状态，取样计数，当培养体系达到180-200ml时，将细胞转入细胞培养袋中，按照20-50ng/ml向培养袋中补加CD3和CD28单抗，根据计数结果补加T淋巴细胞完全培养基，调整细胞浓度在0.5-0.8×10⁹/L，继续细胞培养；