[发明专利]一种莱茵衣藻RAB7蛋白的多克隆抗体、制备方法和应用

权利要求书

1.一种莱茵衣藻RAB7蛋白的多克隆抗体，其特征在于：所述多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻RAB7蛋白；

所述莱茵衣藻RAB7蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，所述莱茵衣藻RAB7蛋白的核苷酸序列如SEO ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的莱茵衣藻RAB7蛋白的多克隆抗体在检测莱茵衣藻RAB7蛋白方面中的应用。

3.一种检测莱茵衣藻RAB7蛋白的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1所述的多克隆抗体。

4.一种如权利要求1所述的莱茵衣藻RAB7蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

构建重组表达载体，所述重组表达载体的核苷酸序列包括如SEO ID NO.2所示的序列；

将所述重组表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中，得到重组表达菌株；诱导重组表达菌株的蛋白表达，得到莱茵衣藻RAB7蛋白；

将莱茵衣藻RAB7蛋白经过亲和纯化后作为免疫原免疫动物，得到莱茵衣藻蛋白RAB7的多克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的莱茵衣藻蛋白RAB7的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：构建重组表达载体的方法包括：

将莱茵衣藻cc-125cDNA作为模板，进行PCR扩增，获得莱茵衣藻rab7目的基因；

将莱茵衣藻rab7目的基因与原核表达载体pET-28a(+)连接，得到重组表达载体pET-28a(+)-rab7。

6.根据权利要求5所述的莱茵衣藻蛋白RAB7的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：在PCR扩增时采用上游引物和下游引物进行扩增，所述上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物如SEQ ID NO.4所示；

扩增程序为：预变性95℃，5min；

(变性95℃，45s；退火58℃，30s；延伸72℃，1min)×35个循环；

延伸72℃，5min。

7.根据权利要求4所述的莱茵衣藻蛋白RAB7的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述诱导重组表达菌株的蛋白表达的具体方法包括如下步骤：

挑取重组表达菌株的单克隆到含有卡那抗性的LB液体培养基中，37℃过夜培养，以1:20的体积扩大培养，当600nm处的吸光值A值达到0.6～0.8时，加入1M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，使其终浓度至0.2mM，且诱导的温度为25℃，诱导的时间为8h，将收集菌体高压破碎，全蛋白、上清和沉淀进行12％SDS-PAGE分析蛋白表达情况，在25kDa处能够看到RAB7蛋白大量表达并且表达在上清液中，由此得到莱茵衣藻RAB7蛋白。

8.根据权利要求4所述的莱茵衣藻蛋白RAB7的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：将得到的莱茵衣藻RAB7蛋白进行纯化，纯化的方法包括：

将莱茵衣藻RAB7蛋白进行亲和纯化，将上清液即莱茵衣藻RAB7蛋白用0.45μm滤膜过滤后加入预先平衡好的Ni Sepharose^TM6Fast Flow蛋白纯化柱中，室温条件下结合2h，用含20mmol/L咪唑的Tris盐溶液漂洗3次，最后用含500mmol/L咪唑的pH＝8.0的Tris-HCl溶液洗脱；

将收集的全蛋白、沉淀、流穿液、漂洗液、洗脱液用12％SDS-PAGE检测，选择浓度＞0.5mg/ml、纯度＞85％的目标蛋白用于后续动物免疫实验；

其中，含20mmol/L咪唑的Tris盐溶液为：20mM咪唑，50mM pH 7.4Tris-HCl，0.5mol/LNaCl，溶剂为水；

含500mmol/L咪唑的pH＝8.0的Tris-HCl溶液为：500mM咪唑、50mM pH 7.4Tris-HCl、0.5mol/LNaCl，溶剂为水。