[发明专利]一种莱茵衣藻RAB7蛋白的多克隆抗体、制备方法和应用

说明书

本发明公开一种莱茵衣藻RAB7蛋白的多克隆抗体，所述多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻RAB7蛋白；所述莱茵衣藻RAB7蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，所述莱茵衣藻RAB7蛋白的核苷酸序列如SEO ID NO.2所示。本发明莱茵衣藻RAB7蛋白多克隆抗体能特异性识别莱茵衣藻RAB7蛋白，且具有效价高和特异性好的特点；该莱茵衣藻RAB7蛋白多克隆抗体可用于莱茵衣藻RAB7蛋白的检测以及后续以莱茵衣藻为模式生物的RAB7蛋白的功能研究。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种莱茵衣藻RAB7蛋白的多克隆抗体、制备方法和应用。

背景技术

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种细胞结构较为单一的藻类生物，细胞大小在10μm左右，胞体侧面长有一个眼点，胞内含有一个或多个液泡以及一个呈“U”型的半环状叶绿体，与细胞核、蛋白核、线粒体等藻细胞结构相比，叶绿体体积相对偏大，约占细胞总体积的40％。莱茵衣藻细胞结构虽简单却具有与动物细胞相似的特征，其中最典型的特点是在细胞顶部长有两根等长的鞭毛，使其能够自由运动。由于其运动鞭毛与哺乳动物的纤毛具有相同的结构和许多相同的组成蛋白质，并且关键蛋白的同源性达到90％以上，因此目前对哺乳动物纤毛的认识在很大程度上依赖于以莱茵衣藻为模式生物的研究。

纤毛是一种从基体(源自中心粒)顶端延伸而出，基于微管呈毛发状突出于细胞表面的细胞器，广泛分布于多种细胞表面，并已进化到在感知内外环境、驱动细胞运动和信号传导等方面发挥作用。纤毛主要由基体、纤毛膜及轴丝三部分组成，是进化上保守的细胞器。初级纤毛在信号转导、细胞增殖和分化以及胚胎发育等方面都具有重要功能，它的组装或者功能的缺陷，会直接引起很广泛的人类疾病，这类疾病现在被定义为纤毛类营养病，如视网膜变性、多囊肾、巴德-毕氏综合征等。

RAB蛋白家族是小G蛋白超家族中最大的亚家族，广泛存在于动物、植物和微生物等真核生物中，在进化过程中高度保守，是参与调控细胞内膜运输的关键因子，其中RAB8和RAB11参与了纤毛形成过程中的多个步骤，包括囊泡对接、纤毛膜形成以及鞭毛内运输。当纤毛进入细胞分裂期前，需要进行中心粒的复制及运动时，需要进行纤毛的解聚，其解聚异常会导致细胞周期进程受阻。2019年，Wang等鉴定了RAB7是一种新的纤毛解聚调节因子，通过调控纤毛内F-肌动蛋白聚合在纤毛外胞和纤毛解聚方面发挥作用。RAB7在纤毛形成中起负调控作用，RAB7基因的敲除可以增加初级纤毛的数量和长度来促进纤毛的形成，并且其缺失显著抑制了纤毛外胞现象。RAB7作为一种小G蛋白，可以在无活性(gdp结合)和活性(gtp结合)状态之间不断转换，而纤毛解聚和纤毛外胞都需要具有活性的RAB7。初级纤毛在细胞信号转导过程中，通过组装和解聚的动态转换发挥其功能，利用衣藻这种模式生物能够更加深入了解纤毛的形成与解聚的机理，为研究RAB7相关的发育缺陷和发病机制提供线索，进一步揭示纤毛病发生的遗传基础和分子机制，对纤毛病的预防、诊断和治疗提供依据。

本发明以实验室保存的莱茵衣藻cDNA为模板，通过设计的引物做PCR扩增，得到大小为621bp的rab7基因的目的片段；将PCR扩增得到的rab7片段和pET-28a(+)载体同时用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，将目的基因与载体片段回收，以摩尔质量比为1:3室温用T₄DNA连接酶连接1h；转化至E.coli XL1-blue，在含有相应抗性的平板上37℃过夜培养；挑取转化子至LB液体培养基中过夜培养，提取质粒后用BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切验证，条带大小与预期一致则进行测序验证。

经检索，本发明在国内外未见公开报道，在国内外未见公开使用。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种莱茵衣藻RAB7蛋白的多克隆抗体、制备方法和应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种莱茵衣藻RAB7蛋白的多克隆抗体，所述多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻RAB7蛋白；