[发明专利]基于基因多拷贝筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法

权利要求书

1.基于基因多拷贝筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，包含如下步骤：

步骤一：构建重组质粒pPICZαA-GDH，将质粒pUC57-GDH和质粒pPICZαA分别进行EcoR I和Not I双酶切，酶切产物分别用1％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收，得到有相同粘性末端的目的基因GDH和载体；用T4连接酶连接回收产物，连接后的产物转化入大肠杆菌Top10感受态，对鉴定出的阳性克隆提取质粒进行酶切、测序，比对分析重组质粒构建成功；

步骤二：构建多拷贝重组表达载体，利用pPICZαA含有的两个同尾酶Bg lII和Bam HI酶切位点，构建基因多拷贝重组质粒；

步骤三：不同基因拷贝数阳性转化子的获得及重组蛋白的诱导表达，将构建成功的不同拷贝数重组载体质粒进行Bam H I线性化后分别电转表达宿主Pichia pastoris X33感受态，构建重组菌株；

步骤四：发酵罐放大表达FAD-GDH，选择一株单拷贝菌株和一株四拷贝菌株进行发酵罐扩大培养，挑单克隆接种于YPD培养基培养10h，按3％接种量转接于100mL BMGY培养基至OD₆₀₀≈6-8接种于发酵罐。

2.根据权利要求1所述的基于基因多拷贝筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，所述步骤一中，FAD-GDH基因序列有Bgl II酶切位点，不利于后期同尾酶法构建基因多拷贝菌株，设计引物将1404位点由A突变为G，引物序列为A-G：FATCAGAAGGTCTTTCGAGTCTTACCCTTTG；A-G：RGAAAGACCTTCTGATGTACTTAGCAACAGCA，用Q5连接酶进行PCR扩增，程序为：98℃，5min；98℃，30s，退火温度分别设为58℃、60℃、62℃，60s，72℃，延伸10min，20个循环；72℃，延伸20min；16℃，保存；模板采用所述pPICZαA-GDH质粒；PCR结果用DpnⅠ酶消解，热激转化Top10感受态，分别涂布于LB+Zeocin平板上，37℃过夜培养；分别挑取单菌落于LB液体培养基中培养，提取质粒，进行BglII和Bam HI双酶切验证，酶切正确的送测序进一步验证，用于基因多拷贝构建的重组质粒pPICZαA-GDH构建成功。

3.根据权利要求1所述的基于基因多拷贝筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，所述步骤二的具体操作如下：质粒pPICZαA-GDH分别进行BglII和Bam H I双酶切和Bam H I单酶切，然后分别将酶切产物切胶回收，将表达框片段和线性化的重组表达载体片段用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化至大肠杆菌感受态Top10中，筛选阳性克隆子后进行试剂盒提质粒，即得到FAD依赖的葡萄糖脱氢酶两拷贝重组表达载体pPICZαA-2GDH；将两拷贝重组表达载体pPICZαA-2GDH分别进行Bg l II和Bam H I双酶切和Bam H I单酶切，然后分别将酶切产物切胶回收，将表达框片段和线性化的重组表达载体片段用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化至大肠杆菌感受态中，筛选阳性克隆子，即得到4拷贝的重组表达载体pPICZαA-4GDH；两拷贝载体单切线性化与单拷贝的表达框连接得到3拷贝的重组表达载体pPICZαA-3GDH，同理，得到多拷贝重组表达载体。

4.根据权利要求1所述的基于基因多拷贝筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，所述步骤三中，电转条件：2Kv，4-5ms，快速加入1mL预冷的YPDS液体培养基，电转的感受态细胞置于30℃培养箱静置培养2-6h，4000rpm离心5min，弃上清，用1mL生理盐水洗3次，然后将菌液涂布在添加博来霉素Zeocin的YPD平板上，在30℃下培养72h，从而获得转化子；将重组菌株挑取单菌落接种于5mL添加Zeocin的YPCS试管培养基中，14-18h后加1％(v/v)甲醇，之后24h和48h后均各加1％(v/v)甲醇诱导，72h收菌，8000r/min离心5分钟收集上清，上清液利用DCIP的方法测定FAD依赖葡萄糖脱氢酶的活力，并以此来筛选高酶活菌株。