[发明专利]基于基因多拷贝筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法

说明书

本发明提供了一种筛选高表达FAD‑GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，包括如下步骤：通过同尾酶法构建了FAD依赖的葡萄糖脱氢酶FAD‑GDH的2‑4拷贝重组表达载体pPICZαA‑2GDH、pPICZαA‑3GDH和pPICZαA‑4GDH；其中在试管水平，单拷贝平均酶活11.953U/mL，二拷贝平均酶活27.99U/mL，三拷贝平均酶活44.792U/mL，四拷贝平均酶活57.027U/mL；分别比单拷贝提高2.34、3.75、4.78倍；选择单拷贝菌株和四拷贝菌株进行10L罐扩大培养，单拷贝菌株诱导108h酶活达到最高697.125U/mL，四拷贝菌株诱导132h酶活达到最高1063.279U/mL，比单拷贝酶活提高52.52％。本发明表明通过增加目的基因拷贝数策略有助于提高FAD‑GDH的表达量。

技术领域

本发明涉及酵母菌筛选技术领域,更具体的说是涉及一种基于基因多拷贝筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法。

背景技术

FAD依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD-dependent glucose dehydrogenase，简称FAD-GDH，EC 1.1.99.10)，与葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，简称GOD)、吡喃糖脱氢酶、胆碱脱氢酶和甲醇氧化酶同属于GMC氧化还原酶(glucose-methanol-choline-oxidoreductase)家族。它是以FAD为辅基能够在NAD(P)+等存在的情况下催化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸-δ-内酯，而D-葡萄糖酸-δ-内酯会自发形成葡萄糖酸。

在目前使用的血糖检测用酶中，葡萄糖氧化酶(GOD)因其能利用氧作为电子受体，样品中氧分压的改变会使检测结果产生误差，而GDH不利用氧作为电子受体，不会产生此种偏差，适用于检测包括静脉血、动脉血、高海拔等氧气含量不同的样本，近年来成为便携式血糖监测系统的研究热点。

外源基因拷贝数(基因剂量)的多少对外源重组蛋白的表达有着显著的影响，外源基因利用单交换整合至毕赤酵母中往往易产生多拷贝菌株，许多报道表明单拷贝的外源基因往往导致较低的外源重组蛋白产量，而随着拷贝数的增加可以有效提高外源目的蛋白的表达，通常在一定基因剂量范围内，基因剂量与外源目的蛋白的产量成正比关系。例如，Sunga等人报道在pFLD1启动子控制下，β-半乳糖甘酶基因拷贝数增加到22时，其酶活比单拷贝提高了17倍；Vassileva等采用pAOX1表达载体构建了毕赤酵母重组菌株，外源乙肝疫苗基因剂量为1至8个拷贝，实验结果发现乙肝疫苗表达水平与基因拷贝数呈正线性相关，然后通过Nonhem分析发现乙肝疫苗mRNA表达水平与基因拷贝数成正线性相关；Zhu等人采用体内构建法构建了猪胰岛素前体基因的重组毕赤酵母菌株，结果发现基因剂量与目的蛋白产量呈现钟形的相关曲线关系，在拷贝数为12个拷贝时达到最高产量180mg/L。

因此，提供一种能实现FAD-GDH的高效表达方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于基因多拷贝筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法，通过同尾酶法构建FAD-GDH基因的多拷贝表达盒载体，并转入毕赤酵母X33后筛选优质的重组表达菌株，研究不同拷贝数对酶活表达的影响，筛选得到含高拷贝目的基因并具高表达水平的重组毕赤酵母菌株。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于基因多拷贝筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法，包含如下步骤：

步骤一：构建重组质粒pPICZαA-GDH，将质粒pUC57-GDH和质粒pPICZαA分别进行EcoR I和Not I双酶切，酶切产物分别用1％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收，得到有相同粘性末端的目的基因GDH和载体；用T4连接酶连接回收产物，连接后的产物转化入大肠杆菌Top10感受态，对鉴定出的阳性克隆提取质粒进行酶切、测序，比对分析重组质粒构建成功；

步骤二：构建多拷贝重组表达载体，利用pPICZαA含有的两个同尾酶Bg lII和BamH I酶切位点，构建基因多拷贝重组质粒；