[发明专利]一种基于NGS平台的微生物定量方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于NGS平台的微生物定量方法及试剂盒。所述方法包括：将针对目标微生物的基因组上目标区域的引物和镜像序列与待测样本混合，进行文库制备及测序，根据测序结果计算目标微生物含量，所述镜像序列包括引物结合区和非引物结合区，所述引物结合区的核酸序列与所述目标微生物的基因组上目标区域的引物结合区的核酸序列相同，所述非引物结合区与所述目标微生物的基因组上目标区域的非引物结合区互补或为其反向核酸序列。本发明针对不同目标微生物的特异性序列，设计相对应的镜像序列，共同进行建库及测序，镜像序列可以作为靶标序列的理想对照，等比换算得到准确的目标微生物含量，计算出目标微生物的真实含量。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于NGS平台的微生物定量方法及试剂盒。

背景技术

随着高通量量测序技术(NGS)的发展，基于NGS平台的分子生物学技术在微生物检测中应用越来越广泛。目前基于高通量测序技术的微生物检测方法主要有两种方式：一种方式为微生物全基因组测序(mNGS)，可以广覆盖的一次性检测2万种以上的微生物，也是目前实验室广泛使用的检测技术之一；另一种方式为靶向测序技术(tNGS)，利用探针捕获或多重PCR进行富集后进行测序，即设计特异性引物或探针，进行目标微生物富集，选择性富集目标基因组上的靶标基因或序列，然后进行测序和下游分析。靶向测序一次性可以检测几十至几千种微生物，灵敏度和检测成本较mNGS都具有较大优势，也是目前临床应用的新兴技术。

但目前两种NGS的方法虽然可以实现微生物的广谱检测，却在微生物定量方面存在一定的不足，mNGS和tNGS主要通过各样本中微生物的reads数来计算种类和含量、丰度、相对量等指标，存在以下几个问题：(1)对于mNGS在不同的宿主背景，和背景菌，其他强阳微生物的干扰下，即使相同浓度的微生物，检测的序列数相差很大，因此，微生物序列数并不能充分反映样本微生物含量，微生物浓度定量非常困难；(2)比较与mNGS技术，tNGS不受宿主和背景菌影响，影响因素少，但在其他强阳微生物干扰下，目标微生物的序列数也会受到较大的影响；(3)tNGS靶标的序列成分：序列的GC含量差异和引物的长短，引物的退火温度，探针的捕获效率等均影响富集效率；(4)tNGS目标区域的富集效率差异，也会使得不同微生物的序列数不能客观反映其含量，因此，通过其他引入的靶标内参也无法直接定值。

综上所述，提供一种进行能够准确定量的微生物检测方法，且操作简单、成本低，对于微生物检测领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种基于NGS平台的微生物定量方法及试剂盒，设计目标微生物的镜像序列，共同进行建库及高通量测序，能够进行准确定量检测，且操作简单、成本低。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种基于NGS平台的微生物定量方法，所述方法包括：

将针对目标微生物的基因组上目标区域的引物和镜像序列与待测样本混合，进行文库制备及测序，根据测序结果计算目标微生物含量；

所述镜像序列包括引物结合区和非引物结合区，所述引物结合区的核酸序列与所述目标微生物的基因组上目标区域的引物结合区的核酸序列相同，所述非引物结合区与所述目标微生物的基因组上目标区域的非引物结合区互补或为其反向核酸序列。

本发明中，对于DNA片段，在目标区域(非引物区)可设计其核酸片段(如示意图1)，即3’-5’端反向序列或5’-3’互补序列，镜像序列和原序列享有相同的序列成分，共享相同的扩增引物，在湿实验过程中，如引物的退火温度，引物长度，GC含量，PCR扩增效率、测序效率等多方面相当，具有可比性，并且与真实的微生物目标序列可以明显区分，可以作为目标序列的理想对照，即，基于镜像序列实现靶向扩增子测序中的定量。

本发明的微生物定量方法可广泛应用，包括农业病害鉴定与预测、食品安全检测和病原微生物检测等。