[发明专利]基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法

说明书

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法。hNSC的构建，miR‑93基因突变pegRNA构建，miR‑302d基因突变pegRNA构建，基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的获得。本发明的hNSC制剂的生产，解决了人神经干细胞在医学应用中来源受伦理学影响、相对获取困难的问题，同时提升了Nurr1蛋白在hNSC中的表达功能且解决了hNSC移植后向多巴胺神经元分化效率低的问题，可以用于帕金森疾病及其他神经系统疾病的防治，并能为类似新型细胞的开发提供参考。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种基于hiPSC细胞构建的神经干细胞制剂的制备方法。

背景技术

神经干细胞在神经系统疾病治疗方面引起广泛关注，并在临床上取得一定疗效，但临床广泛应用及远期效果仍存在难以逾越的瓶颈。神经干细胞移植治疗目前主要分为异体移植和自体移植。异体移植的常见细胞来源为人类胚胎中脑组织及人类胚胎干细胞，对人类胚胎中脑组织移植研究证实，在胚胎纹状体来源的多巴胺神经元移植到帕金森患者的大脑后能持续存活和生长，在功能整合后可重新支配失神经的纹状体，且恢复纹状体多巴胺释放，明显缓解帕金森症状。鉴于胚胎中脑组织的获得量有限且难以标准化，这使它不可能成为大量移植的可靠来源。而人胚胎干细胞由于其增殖潜能，可提供大量的神经干细胞。此外hESCs能够在体外无限、未分化增殖，并保留分化为所有细胞类型的潜力。在帕金森大鼠模型中，胚胎干细胞移植到纹状体后分化为成熟的神经元，且移植物含有高达20％的多巴胺神经元，这与胚胎中脑组织移植相当。虽然利用人类胚胎干细胞作为细胞移植治疗得到认可，但人类胚胎科学研究的伦理问题限制了这一研究。此外，由于胚胎干细胞保留了分化为各种组织的能力，有在着床部位形成畸胎瘤的风险，且因其异体移植的免疫排斥反应而限制其应用。

因此，目前针对神经系统疾病，人诱导多功能干细胞(hiPSCs)及人神经干细胞(hNSC)为常用细胞移植来源。hiPSCs细胞在形态、基因表达谱和分化潜能上与人胚胎干细胞相似。当hiPSCs移植到6-羟多巴胺介导的帕金森大鼠模型中时，hiPSCs在脑内分化为多巴胺神经元，显著改善帕金森运动行为，且无肿瘤形成。但由于hiPSCs特异性分化能力较差，使其移植后畸胎瘤形成的风险增加。

神经干细胞与这些细胞(人胚胎干细胞、hiPSCs)相比具有的明显优势是具有定向分化能力，且神经干细胞易于体外培养。神经干细胞具有多种来源，其中hiPSC诱导分化成神经干细胞是最便捷的途径之一，而且避免很多伦理学限制。神经干细胞在特定条件下可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。由于这种特定的种系限制，肿瘤的形成风险极低，并且神经干细胞更容易被引导向神经元分化。但是移植的神经干细胞持续存活及定向诱导分化是亟待解决的关键问题。

虽然目前神经干细胞移植在帕金森等神经系统疾病治疗中引起较多关注，但一些研究表明，在成人大脑中移植的神经干细胞偏向于神经胶质细胞和少突胶质细胞分化，向神经元分化的能力很差，无法达到缓解疾病的目的。核受体相关因子(Nurr1)是甲状腺激素/维甲酸核受体超家族的转录因子。有研究发现，鼠来源Nurr1在胚胎10.5d即在中脑腹侧表达，并且持续表达于成年脑组织的中脑腹侧和黑质区。Nurr1被认为是中脑多巴胺神经元发育的重要因子。大量研究表明，Nurr1对多巴胺神经元发育、生存和功能维持起着重要的作用。因此，Nurr1基因过表达的神经干细胞更易向多巴胺神经元分化。但是在帕金森患者或神经干细胞移植后的神经组织中，Nurr1基因表达被抑制而影响多巴胺神经元的生成。其本质原因是miR-93和miR-302d靶向Nurr1 mRNA降低了该基因翻译成蛋白。miR-93在Cops6基因内含子区，miR-302d在基因Larp7内含子区，如果对miR-93和miR-302d进行基因组编辑突变(Primer Editing技术)，并不影响其所在基因Cops6和Larp7在细胞内的功能。

目前，针对帕金森等神经系统疾病在治疗过程中神经干细胞来源不足、伦理学障碍以及移植后神经干细胞向多巴胺神经元分化障碍等问题，至今仍未能有效解决。

发明内容