[发明专利]FGF10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法

权利要求书

1.一种FGF10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）CIITA基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建

设计双gRNA序列，然后将双gRNA序列克隆进表达载体，获得pU6gRNA-Cas9-GFP-CIITA敲除载体；

（2）CIITA基因缺陷型人成纤维细胞的构建

将pU6gRNA-Cas9-GFP-CIITA敲除载体转染人成纤维细胞，得到CIITA基因缺陷型人成纤维细胞；

（3）SPRY2基因酪氨酸突变pegRNA构建

设计SPRY2基因gRNA和SPRY2基因突变模板及反转录引物序列，将SPRY2基因gRNA、Scaffold序列和SPRY2基因突变模板及反转录引物序列合成SPRY2基因酪氨酸突变pegRNA；

（4）NLRC5基因核定位序列突变pegRNA构建

设计NLRC5基因gRNA和NLRC5基因突变模板及反转录引物序列，将NLRC5基因gRNA、Scaffold序列和NLRC5基因突变模板及反转录引物序列合成NLRC5基因核定位序列突变pegRNA；

（5）FGF10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的获得

将PE2系统mRNA、SPRY2基因酪氨酸突变pegRNA和NLRC5基因核定位序列突变pegRNA混合，然后加入到CIITA基因缺陷型人成纤维细胞中进行电转染，筛选，扩大培养，得到FGF10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂；

步骤（1）中所述的双gRNA序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

步骤（3）中所述的SPRY2基因gRNA为SEQ ID NO.3所示的序列，Scaffold序列为SEQ IDNO.4所示的序列，SPRY2基因突变模板及反转录引物序列为SEQ ID NO.5所示的序列；

步骤（3）中所述的SPRY2基因酪氨酸突变pegRNA为SEQ ID NO.6所示的序列；

步骤（4）中所述的NLRC5基因gRNA为SEQ ID NO.7所示的序列，Scaffold序列为SEQ IDNO.4所示的序列，NLRC5基因突变模板及反转录引物序列为SEQ ID NO.8所示的序列；

步骤（4）中所述的NLRC5基因核定位序列突变pegRNA为SEQ ID NO.9所示的序列；

步骤（5）中所述的PE2系统mRNA的制备方法是按照pCMV-PE2-P2A-GFP质粒的序列合成PE2系统mRNA。

2.根据权利要求1所述的FGF10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤（5）中所述的电转染的时间为48-72h。

3.根据权利要求2所述的FGF10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤（5）中所述的电转染的时间为72h。

4.根据权利要求1所述的FGF10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤（5）中所述的筛选是采用HLA class I阴性细胞流式细胞仪筛选和FGF10阳性筛选。