[发明专利]FGF10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种FGF10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法。CIITA基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建，CIITA基因缺陷型人成纤维细胞的构建，SPRY2基因酪氨酸突变pegRNA构建，NLRC5基因核定位序列突变pegRNA构建，FGF10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的获得。本发明的成纤维细胞制剂的生产，提升了移植细胞形成良性微环境的功能且降低了免疫排异，细胞能做到储存后随取随用，可以用于医学美容、关节炎及其他疾病的防治，并能为类似新型细胞的开发提供参考。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种FGF10旁分泌通用型人成纤维细胞制剂的制备方法。

背景技术

成纤维细胞是动物中最常见的结缔组织细胞，是一种存在于大多数组织中间充质细胞，在组织结构支持中起主要作用，并且能够分泌和应答细胞因子，如成纤维细胞生长因子FGF10等等，参与创面愈合的多个阶段。皮肤成纤维细胞是参与创面修复的主要修复细胞，其功能正常与否直接影响创面肉芽组织生成和创面愈合。以往成纤维细胞增殖障碍是研究的热点，近年来其异质性及其与其他细胞间的通讯正逐渐引起重视。成纤维细胞是真皮中的主要细胞，其负责细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白的合成和重塑，是相对“被动”的细胞。然而，真皮成纤维细胞群具有异质性，由不同的细胞亚群组成，在创面环境的应激条件下，成纤维细胞通过分泌或接收多种信号分子参与调节炎症反应和细胞增殖，通过细胞与细胞的直接通讯以及自分泌和旁分泌相互作用调节角质形成细胞、内皮细胞和巨噬细胞的功能，形成良性微环境。

一些慢性创面上皮边缘组织过度增生堆积导致无法再上皮化，难愈合创面边缘的角质形成细胞不仅迁移和增殖延迟，而且也丧失了与其他细胞通讯的能力。适当补充外源人成纤维细胞对创面有很好的效果，因为慢性创面中大多数成纤维细胞过早衰老，形态异常和迁移障碍以及由p38-MAPK通路上调引起的增殖能力下降，不利于与其他细胞形成良性微环境。

人成纤维细胞在创面修复或其他应用过程中，新移植的细胞不能很快与周围组织建立“联系”的微环境，往往导致使用效果较差。成纤维细胞生长因子(FGF)是成纤维细胞接受的最重要的信号之一，其能够调控成纤维细胞的生长、以及其他细胞因子的分泌和调节成纤维细胞与其他细胞交互。但是由于新移植细胞微环境形成较慢，导致细胞也不能有效接受FGF的信号，针对此迫切需要改进成纤维细胞，实现FGF旁分泌生成，促进微环境形成。同时，成纤维细胞往往取自于自体，培养后用于自体，但是该类增殖较慢也影响到细胞的使用，为了解决此问题，可以构建通用型细胞，实现细胞的随取随用。

FGF家族由22名成员组成，通过内分泌或旁分泌机制发挥作用。FGF10是旁分泌家族成员，表达起始于肺发育早期，主要通过调控上皮和间充质干细胞增殖、分化及迁移，介导上皮间质细胞间互作，在皮肤成纤维细胞中表达能够促进伤口愈合和组织修复，但其表达受到Sprouty 2(SPRY2)蛋白的抑制。SPRY2蛋白是一种膜相关蛋白，在组织生长和发育建模中被认为是FGF/EGF信号通路的调节器。在许多发育过程中，SPRY2也被认为是FGF10所介导的RTK通路的拮抗剂，其高表达会抑制成纤维细胞旁分泌FGF10因子，造成成纤维细胞周边组织不容易形成良性微环境。SPRY2除了通过第55位酪氨酸磷酸化调控FGF10信号通路以外，还可以通过其他结构域调控EGF和VEGF信号通路。

影响细胞移植后微环境形成的还有机体对成纤维细胞的免疫排异，排异不仅造成移植后的细胞生存时间缩短，还诱发强烈的机体炎症。诸多研究已经证实，通过基因组编辑的方法敲除细胞中I类和II类MHC可以极大降低免疫排异，该两类MHC复合体种类繁多、基因大，给直接敲除带来诸多不便或敲除效果不好。

目前，在医学美容、关节炎、创面治疗或康复保健中使用人成纤维细胞存在免疫排异、FGF10旁分泌弱而不能有效刺激新移植细胞形成良性微环境等问题，至今未能有效解决。

发明内容