[发明专利]一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的CPA引物组合及方法

说明书

本发明公开了一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的交叉引物核酸恒温扩增引物组合和方法。该引物组合用于检测stx1a、stx1c、stx1d、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e、stx2f和stx2g共10种基因亚型，包含核苷酸序列为SEQ ID NO:1～5的引物组I，SEQ ID NO:6～10的引物组II,SEQ ID NO:11～20的引物组III。本发明提供的方法操作简单，特异性好、灵敏度高，可在50min内完成核酸检测，为监管部门对重大活动保障和突发应急事件中食品致病菌检测提供快速的筛查结果。同时，本发明首次设计筛选引物组合实现STEC全部基因亚型的检测，结合核酸检测试纸条及一体化检测装置可实现全过程无仪器依赖及可视化结果判断，极大满足了现场检测的需求。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，特别涉及一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的CPA引物组合、试剂盒及方法。

背景技术

产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC)是近年来出现的一群重要的食源性致病菌，在多国引发人的感染和流行。尽管O157∶H7是STEC典型的血清型，但是近年来非O157 STEC感染病例全球性的增加也预警了研究调查非O157 STEC的重要性。STEC可导致患者出现腹泻、出血性结肠炎，其中有2％～7％的病人出现血栓性血小板减少性紫癜及溶血性尿毒综合征，严重者甚至死亡，所以STEC引起的食源性疾病已成为严重的公共卫生安全问题。严重威胁着人们的健康。因此,快速、准确的检测STEC是有效预防和控制感染的前提条件。

目前,检测STEC的主要分子靶点是编码志贺毒素的stx基因，国家标准化组织和美国农业部均采用实时荧光定量PCR对食品中STEC进行初筛。但荧光定量PCR必须依赖昂贵的精密仪器，检测费用较高，对检测人员也有较高的技术要求，无法满足现场检测的需求。交叉引物扩增法(Crossing-primer amplification,CPA)是我国唯一独立知识产权的恒温扩增技术，可以在恒温条件下快速、特异、灵敏地扩增目标序列，并且不需要昂贵的检测设备，大大降低了检测费用的同时，可以直接应用于食品安全现场保障和应急检测。另一方面，相比于其他恒温扩增技术，交叉引物扩增通过对检测引物进行标记，在扩增完成后直接胶体金层析进行可视化观察结果，更适合于现场检测。

stx基因亚型的突变和重组现象较为普遍，现有报道的基因型主要有10种，其中stx1基因亚型3种，分别是stx1a，stx1c，stx1d；stx2基因亚型7种，分别为stx2a，stx2b，stx2c，stx2d，stx2e，stx2g，stx2f。不同基因亚型之间核苷酸序列差异较大，很难用一种通用引物同时扩增所有亚型。如携带stx1a的STEC可引起HUS，但携带stx1c的菌株仅能引起轻微腹泻，或者没有明显的症状，携带stx2a，stx2c，stx2d的STEC均可引起严重的临床症状，而携带stx2b，stx2e，stx2f的STEC较为温和，不会引发严重的临床症状。食品中低于100CFU的STEC菌体就可能导致人类患病，STEC共有超400种血清型，在非O157:H7血清型的产志贺毒素大肠埃希菌(Non-O157 STEC)中，有6种被认为是检出率最高、危害较大的菌株，分别是O26(22％)、O111(16％)、O103(12％)、O121(8％)、O45(7％)和O145(5％)。美国疾控中心发布的数据显示，2016年美国有5 441例经确认的STEC感染事件，预估有超过26万名患者，导致30人死亡。国际上主要采用实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chainreaction，real-time PCR)对其进行检测，其中使用较广的国际标准化组织(International Organization for Standardization，ISO)和美国农业部(UnitedStates Department of Agriculture，USDA)方法也采用该技术对疑似含STEC的增菌培养物进行初筛。然而，real-time PCR方法需要温度在50～100℃间不停变化，对相关检测设备要求较高，无法便携携带，较难满足基层实验室和现场快速检测的需求。

发明内容