[发明专利]一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用

权利要求书

1.一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)PCR扩增目的基因：引物设计及目的基因的PCR扩增；设计一对特异性引物扩增IFNα2b基因片段，上游引物和下游引物中分别引入NcoI和XhoI酶切位点；PCR方法对IFNα2b基因片段进行扩增；

(2)将原核表达载体pET28a(+)和PCR合成的DNA片段均经NcoI和XhoI进行双酶切，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析；胶回收目的基因片段及载体片段，然后用T4 DNA连接酶将载体和目的片段连接；

(3)IFNβ2b基因片段经PCR扩增和双酶切，与同样经双酶切的pET28a载体连接，转化到Top10感受态细胞中，以菌落PCR进行阳性克隆筛选；菌落PCR筛选为阳性的菌落，进行质粒提取，并进行NcoI和XhoI双酶切鉴定，同时进行基因测序，将测序正确的质粒，转化感受态细胞BL21(DE3)；挑取单克隆，制得表达干扰素α2b的工程菌株IFNα2b/BL21(DE3)；

(4)干扰素α2b的纯化:step1 IFNα2b的粗提；Step2 IFNα2b的层析纯化。

2.根据权利要求1所述的干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的上游引物IFNα2b-F的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述的下游引物IFNα2b-R的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的PCR反应体系为：2x Tris Buffer 25μL，dNTP Mix(10μM each)1μL，Primer F(10μM)1μL，Primer R(10μM)1μL，Template DNA 1.5μL，50x PCR Enhancer 1μL，High-Fidelity DNA polymerase 0.5μL，ddH₂O 19μL，共50μL；PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸35s，共32个循环；72℃再延伸7min；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

4.根据权利要求3所述的干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法，其特征在于：在步骤(2)中，以T4 DNA连接酶于22℃连接1.5h；在步骤(4)中，IFNα2b的粗提:S1菌体裂解：将约300g湿菌体用3000ml裂解液(50mmol/L NH₄Cl，5mol/L EDTA，pH8.0)重悬，1200bar高压裂解三次，10000g的离心力离心50min，取上清；

S2硫酸铵沉淀：取裂解上清边搅拌边加入固体硫酸铵至饱和度为25％，继续搅拌60min；12000g的离心力离心30min，取上清；上清中边搅拌边加入固体硫酸铵至饱和度为55％，继续搅拌60min，12000g的离心力离心30min，留蛋白沉淀。