[发明专利]一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用

说明书

本发明公开了一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用，包括如下步骤：(1)PCR扩增目的基因；(2)将原核表达载体pET28a(+)和PCR合成的DNA片段均经NcoI和XhoI进行双酶切；(3)IFNα2b基因片段经PCR扩增和双酶切，与同样经双酶切的pET28a载体连接，转化到Top10感受态细胞中，菌落PCR筛选为阳性的菌落，进行质粒提取，并进行NcoI和XhoI双酶切鉴定，将测序正确的质粒，转化感受态细胞BL21(DE3)；挑取单克隆，制得表达干扰素α2b的工程菌株IFNα2b/BL21(DE3)。干扰素α2b表达菌株破菌后，经硫酸铵沉淀，四步离子交换和疏水层析、以及超滤等分离纯化。本发明表达和纯化的重组人干扰素具有良好的效率、回收率和活性，产品质量远高于国家药典规定的质量标准。

技术领域

本发明涉及生物标志物检测技术领域，具体涉及一种干扰素α2b重组表达质粒的构建、可溶性重组表达、分离纯化方法及其应用。

背景技术

干扰素α2b是干扰素α2的一个亚型，在众多的人干扰素种类中，干扰素α的抗病毒活性最强，是临床上治疗肿瘤最常用的干扰素。干扰素α至少含有13种亚型，其中干扰素α2(α2a和α2b)被广泛用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎、带状疱疹、尖锐湿疣和某些白血病、恶性肿瘤等疾病。近年来，干扰素α2b被用于COVID-19病毒感染的患者，显示出较好的疗效。

人IFNα2b(UniProtKB数据库编号：P01563)全长188个氨基酸，其中1～23号氨基酸是信号肽，成熟蛋白中信号肽是要被去除的，一般所说的人IFNα2b也就是由24～188这165个氨基酸组成。

干扰素α2b的分子量在19kD左右，pI为6.0左右，生理条件下带负电。与II型干扰素对酸敏感不同的是，I型干扰素，包括干扰素α2b，具有耐酸性[10]，在pH 2.0～10.0中很稳定。干扰素α2b对热也是比较稳定的，在-20℃下可长期稳定保存。

重组人干扰素α2b作为一种上市药物，被广泛用于治疗慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、恶性黑色素瘤等多种疾病的治疗，产生了良好的临床疗效和经济效益。目前国内厂家生产的干扰素都是经过基因工程表达生产，并且以大肠杆菌表达为主。大肠杆菌表达的人干扰素α2b以包涵体的形式表达，包涵体产物需通过变性复性以及其后的纯化才能获得生物活性。干扰素复性得率低，纯化时需要经过四步色谱处理，工艺繁琐，成本高，而且无法去除未完全复性的中间产物，从而影响产品质量和疗效。

建立可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵工艺，并建立其在此基础上的高效、快速和稳定的纯化工艺。通过发酵罐发酵获得可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵，收集菌体后，通过高压破菌、硫酸铵分级沉淀、phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析、QSepharose Fast Flow阴离子交换层析、SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析、OctylSepharose Fast Flow疏水层析进行纯化，并对纯化产物进行生物活性分析。

重组人干扰素α2b工程菌的发酵密度OD600达到38.5，可溶性重组人干扰素α2b占菌体总蛋白的14.0％；100克湿菌可平均纯化获得240mg纯度接近100％的重组人IFNα2b，比活为1.81x10⁸IU/mg。

干扰素α2b在临床上具有广泛的应用，但是其大规模生产一直是一个难题。目前，国内工业化生产的rIFNα2b大多是以不溶性包涵体表达，以包涵体变复性为纯化手段，经过包涵体清洗、离心、复性、离心、层析等手段获得原液。在包涵体变复性工艺中，复性操作困难，活性损失大、复性耗时长，生产成本高，设备投资大等缺点，而且复性机理复杂，过程难以控制。因此，rIFNα2b在产品的均一性和批间一致性等方面都存在着不小的挑战。而且，在变复性工艺中需要加入变性剂和氧化还原系统，增加了杂质的加入，提高了质控的难度；因此，以包涵体变复性工艺生产的重组干扰素α2b通常无法达到欧盟的质量标准。开发高质量的重组干扰素α2b的表达和生产工艺、建立快速稳定的纯化工艺势在必行。

发明内容