[发明专利]高效精准替换红色毛癣菌基因的方法

说明书

本发明提供了一种高效精准替换红色毛癣菌基因的方法，包括如下步骤：设计红色毛癣菌中EFG1基因片段的上游引物和下游引物序列，并进行扩增；提取PAN7‑1质粒的DNA后，使用引物进行扩增，得到HPH试剂；将扩增后的上游序列、扩增后的下游序列和HPH试剂通过引物进行扩增融合，得到融合的PCR产物；将使用果胶酶制备的原生质体和融合的PCR产物进行转化融合；提取转化子的DNA后，设计引物进行扩增，并验证转化产物；本发明使用果胶酶作为分解酶，可有效对红色毛癣菌细胞壁进行分解，增加外源DNA的渗透率，同时，也避免了由于电能导致多次整合频率的短板，可更加精准地替换靶向基因，取得基因敲除的转化子菌株。

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，具体涉及一种高效精准替换红色毛癣菌基因的方法。

背景技术

临床在治疗皮肤癣菌感染，多使用外用或系统的抗真菌药物，但对于耐受性较强的癣菌感染，尤其是对于皮肤癣菌瘤(Dermatophytoma)这种具有质地坚硬、致密特点的甲真菌感染疾病而言，由于其存在生物被膜结构的可能性，该结构高密度的特点，可能使得抗真菌药物难以渗透，使皮肤癣菌瘤即使长期系统使用抗真菌药物，仍经久不愈，最后多只能通过手术切除等物理性方案介入才能治愈。因此，逆转皮肤癣菌生成可提高耐药性生物被膜、研发新型的抗真菌药物增敏剂及探索相关的靶点，是提高临床治愈率的重要途径。

基因转化是研究真菌病原功能基因组学的核心技术，聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化技术是最早用于丝状真菌(如构巢曲霉和粗糙脉孢菌)的转化技术，之后，有学者成功的将该技术应用于皮肤癣菌的转化研究中，但由于传统方法得到的结果成效不稳定，因此，有学者尝试使用电穿孔的方式，弱化细胞壁的屏蔽作用，增加外源DNA渗透进原生质体内的效率，但由于电穿孔技术需要特定的设备，该方法还可能导致增高外源DNA多次整合到宿主基因组中的频率，而不利于特定内源基因的研究工作，因此，仍需探寻其他更好的解决方案。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明目的是提供一种高效精准替换红色毛癣菌基因的方法。在于利用基因复制时的同源重组，使用含有HPH的基因片段替换掉目的基因，再转移至果胶酶制备好的原生质体中，达到基因敲除的目的。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

根据红色毛癣菌菌种的特异性设计6条特异性引物，将PAN7-1质粒中的HPH片段扩增后，与红色毛癣菌DNA进行融合。具体地，

一种高效精准替换红色毛癣菌基因的方法，包括如下步骤：

引物设计：根据红色毛癣菌的参考基因，设计EFG1基因片段上游、下游DNA序列的扩增引物P1、P2、P3、P4，并摸索扩增最佳条件。

P1：CAAGCAGCAATATAGTTCTCGT(SEQ ID NO.1)

P2：TAGTTCTGTTACGCTCGGCCGGTTTCAGTGGTAGTGATATAGA(SEQ ID NO.2)

P3：GCTCTGAACGATATGCGTTGGATTGAATTAGATATACTGTTTAA(SEQ ID NO.3)

P4：GTGGCGTCGGACCTGAACTTTC(SEQ ID NO.4)

(2)HPH片段扩增：提取PAN7-1质粒的DNA后，使用Hph-n-F和Hph-n-R进行扩增，获得HPH试剂。

Hph-n-F：GGCCGAGGGTAACAGAACTATTCTATTTGTGTTTGATCGAGACC(SEQ ID NO.5)

Hph-n-R：TCCAACGCATATCGTTCAGAGCCCTCTAAACAAGTGTACCTGTGC(SEQ ID NO.6)