[发明专利]一种基于粪便总DNA应用于不同遗传分析的可行性评估方法

权利要求书

1.一种基于粪便总DNA应用于不同遗传分析的可行性评估方法，其特征在于，所述不同遗传分析为SNP分析、STR分型、基于高通量测序的线粒体基因组组装和全基因组重测序，所述可行性评估方法适用于来源于不同物种、不同质量的粪便中提取到的总DNA，具体方法包括如下步骤：

(1)采取绝对荧光定量PCR检测技术对粪便总DNA中的细菌DNA和宿主DNA的拷贝数进行精准测定；所述宿主DNA为mtDNA和nuDNA；

(2)以宿主DNA与细菌DNA拷贝数的比值作为质控指标，建立质控指标与不同遗传分析场景下的实验成功率之间的关系模型，用于评估粪便总DNA在不同遗传分析场景中的可行性。

2.根据权利要求1所述的可行性评估方法，其特征在于，步骤(1)选用16S rRNA基因、ND5基因和RPS27A基因分别作为绝对荧光定量PCR检测中细菌DNA、宿主mtDNA和宿主nuDNA的检测基因。

3.根据权利要求2所述的可行性评估方法，其特征在于，针对16S rRNA基因设计的细菌DNA通用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Bc-16sR1和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的Bc-16sR2。

4.根据权利要求2所述的可行性评估方法，其特征在于，针对ND5基因设计的宿主mtDNA通用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的Mt-ND51和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的Mt-ND52。

5.根据权利要求2所述的可行性评估方法，其特征在于，针对RPS27A基因设计的宿主nuDNA通用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的Nu-S27A1和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的Nu-S27A2。

6.根据权利要求3-5任意一项所述的可行性评估方法，其特征在于，步骤1)中针对三对引物Bc-16sR1/Bc-16sR2、Mt-ND51/Mt-ND52、Nu-S27A1/Nu-S27A建立的绝对荧光定量PCR反应体系为10μL，组成为1μL DNA模板、5μL TB Green Premix ExTaqII、浓度为10μmol/L的上下游引各0.4μL以及3.2μL去离子水。

7.根据权利要求3-5任意一项所述的可行性评估方法，其特征在于，步骤1)中针对三对引物Bc-16sR1/Bc-16sR2、Mt-ND51/Mt-ND52、Nu-S27A1/Nu-S27A2建立的绝对荧光定量PCR反应条件为：95℃/5min；95℃/10s，56℃/30s，72℃/30s，进行40个循环；95℃/10s，65℃/5s，95℃/15s。

8.根据权利要1所述的可行性评估方法，其特征在于，步骤(2)所述由宿主DNA与细菌DNA拷贝数的比值构成的质控指标为宿主mtDNA的相对丰度R_mtDNA以及宿主nuDNA的相对丰度R_nuDNA，分别对应着粪便总DNA中对于宿主mtDNA和宿主nuDNA富集的效率。

9.根据权利要求8所述的可行性评估方法，其特征在于，R_mtDNA的计算方法为：R_mtDNA＝C_mt/C_bc，其中，C_mt为引物Mt-ND51/Mt-ND52扩增产物的拷贝数，C_bc为引物Bc-16sR1/Bc-16sR2扩增产物的拷贝数；R_nuDNA的计算方法为：R_nuDNA＝C_nu/C_bc，其中，C_nu为引物Nu-S27A1/Nu-S27A扩增产物的拷贝数，C_bc为引物Bc-16sR1/Bc-16sR2扩增产物的拷贝数。

10.根据权利要求9所述的可行性评估方法，其特征在于，质控指标与不同遗传分析场景下的实验成功率之间的关系模型具体如下：

以粪便总DNA为模板进行SNP分析时，SNP位点扩增成功率S_SNP与R_nuDNA之间的关系模型为：S_SNP＝56.90+43.10×(1-exp(-R_nuDNA/0.014))，当R_nuDNA达到E-01数量级时，SNP位点扩增成功率可达100％；

以粪便总DNA为模板进行STR分型时，STR位点扩增成功率S_STR与R_nuDNA之间的关系模型为：S_STR＝exp(4.62-0.005/(R_nuDNA+0.0014))，当R_nuDNA达到E-01数量级时，STR位点扩增成功率达到80％以上，而R_nuDNA达到E+00数量级及以上时，STR位点扩增成功率可达100％；

以粪便总DNA为模板进行高通量测序时，当R_mtDNA达到E-01数量级及以上时，可以稳定实现线粒体基因组的完整组装；

以粪便总DNA为模板进行高通量测序时，R_nuDNA和样本序列与参考基因组的比对率(R_map)之间的关系模型为：R_map＝313.77×R_nuDNA^0.36，当R_nuDNA达到E-01数量级及以上时，R_map与采用高质量模板相近。