[发明专利]一种基于粪便总DNA应用于不同遗传分析的可行性评估方法

说明书

一种基于粪便总DNA应用于不同遗传分析的可行性评估方法，属于分子生物学技术领域。为了填补当前粪便DNA应用于不同遗传分析场景下的质控方法以及可行性标准的空白，本发明以细菌的16srRNA基因、动物线粒体基因组上的ND5基因和核基因组上的RPS27A基因为目标，采用相应引物建立荧光定量PCR体系，分别测定粪便总DNA中细菌DNA、动物线粒体DNA(mtDNA)和核DNA(nuDNA)的拷贝数。以细菌DNA的拷贝数为参照，构建了mtDNA和nuDNA相对丰度(R_mtDNA、R_nuDNA)两个指标，并分别建立了粪便DNA应用于以PCR技术为基础的SNP分型、STR分型和以高通量测序技术为基础的线粒体基因组组装和全基因组重测序场景下的成功率与R_mtDNA和R_nuDNA的关系模型，作为预评估粪便DNA在不同遗传分析中可用性的工具。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于粪便总DNA应用于不同遗传分析的可行性评估方法。

背景技术

在野生动物相关研究中，粪便由于可获得性高，可在不伤害、不接触动物的前提下进行采样，并且数量充足、易于收集，目前已成为获取野外或部分饲养动物遗传信息最为常用的非损伤性材料。利用粪便中提取的DNA进行分子生物学分析，不仅可以了解动物的种属、性别、个体识别等个体水平的信息，也可以了解其种群特征，如估算和监测种群数量的动态变化、遗传多样性、群体遗传结构、种群系统发育史、种群间的基因交流等。这些分析为野生动物的生态学、生物学研究提供了坚实的数据基础，在保护生物学和分子生态学领域中得到了广泛应用。

然而在实际应用中，以粪便DNA为模板的分析结果普遍存在着PCR扩增失败、等位基因缺失、等位基因信号峰不平衡、以及基因组重测序中与参考基因组比对率过低等诸多问题。造成这些现象的根本原因在于，粪便中的总DNA中除了动物DNA(或称宿主DNA)外，还包含大量的肠道微生物DNA和残存的食物DNA。其中动物DNA主要来源于脱落的肠上皮细胞，又称内源性DNA，仅占粪便总DNA的极小部分(例如，黑猩猩为0.5％-5.2％，狒狒为0.01％-3.1％)；而外源性DNA以细菌DNA为主体，占据粪便总DNA的95％以上。在大量外源性DNA的干扰下，含量极低的动物DNA参与生化反应的机率大大减少，从而降低了实验的成功率和数据的可靠性。

如果提取的粪便DNA杂质不足以影响实验效果，那么宿主DNA的占比就是实验成功率的决定性因素。不同的应用场景对宿主DNA的占比有着不同的要求，如nuDNA的扩增要高于mtDNA，STR的分型要高于SNP，基因组重测序要高于其他分析。为了克服以上问题，不得不采用多次平行实验的方法来提高数据的可信度，浪费了大量的时间、人力和物力。如果能够对粪便DNA中宿主DNA的占比进行预先评估，就能在确保数据可靠性的前提下大大减少不必要的实验。然而迄今为止针对各个应用场景下质控的方法和标准仍是空白。

发明内容

为了填补当前粪便DNA应用于不同遗传分析场景下的质控方法以及可行性标准的空白，本发明围绕来源于不同物种、不同质量的粪便中所提取的总DNA，针对SNP分析、STR分型、基于高通量测序的线粒体基因组组装和全基因组重测序遗传分析场景，提供了可用性的评估方法以及对应的质控标准，具体评估方法包括如下步骤：

(1)采取绝对荧光定量PCR检测技术对粪便总DNA中的细菌DNA和宿主DNA的拷贝数进行精准测定；所述宿主DNA为mtDNA和nuDNA；

(2)以宿主DNA与细菌DNA拷贝数的比值作为质控指标，建立质控指标与不同遗传分析场景下的实验成功率之间的关系模型，用于评估粪便总DNA在不同遗传分析场景中的可行性。

进一步地限定，步骤(1)选用16S rRNA基因、ND5基因和RPS27A基因分别作为绝对荧光定量PCR检测中细菌DNA、宿主mtDNA和宿主nuDNA的检测基因。