[发明专利]一种利用重离子辐照获得高产蓝色素节杆菌的筛选方法

说明书

本发明涉及一种利用重离子辐照获得高产蓝色素节杆菌的筛选方法，该方法包括以下步骤：⑴将QL17菌株接种到R2A液体培养基中进行摇床培养，得到QL17菌株发酵液；⑵将QL17菌株发酵液用无菌盐水进行连续稀释，得到细菌稀释液；⑶将1.0ml细菌稀释液移入无菌小皿中，采用12C⁶⁺重离子束辐照该细菌稀释液，辐照剂量为500Gy；⑷选取500Gy辐照条件下菌液涂布于R2A琼脂平板上，挑取单个菌落接种于96孔板和R2A琼脂平板中，15℃培养；每12小时在分光光度计上于590nm处检测吸光度，得到蓝色素产量增高最大的突变体，即为天然蓝色素节杆菌，记作M157。本发明解决了抗氧化节杆菌天然蓝色素的产量不足问题，易于实现大规模生产，为天然蓝色素的获取提供了新的途径。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种利用重离子辐照获得高产蓝色素节杆菌的筛选方法。

背景技术

色素是能够吸收可见光并反射剩余脉冲可见光谱(380-750nm)的分子，广泛用于食品、纺织品、化妆品和医疗等行业。目前由于人工合成色素的稳定性和经济性仍大规模占据全球色素市场。然而合成色素的不易降解、易导致过敏和致癌等问题的出现，增强了人们对天然、有机和生态友好型天然色素的需求。

天然色素在自然界中通常以单体(如：类胡萝卜素、黄酮、卟啉、叶绿素、血红蛋白等)和聚合体(如：黑色素、鞣酸类、腐殖质)的形式出现。植物和微生物是天然色素的主要来源，由于植物生长周期较长使植物源色素在大规模应用中受限。相比于植物源的色素，微生物生长周期快，生长成本低且易于大规模培养而使其应用前景更广阔。由于微生物源色素相比于其他来源色素生产成本高，导致其在在市场中不具有竞争力。因此，寻求降低微生物色素生产成本，提高微生物色素产量显得尤为重要。目前，主要通过菌株改良，如物理和化学诱变，或使用低成本、可再生能源来降低微生物色素的生产成本。

作为自然界中三原色之一，红色和黄色都已经有广泛并且成熟的色素应用，唯独蓝色，还没有被发现能够广泛应用在食品染色、医药保健中。因为蓝色素在自然界中较为稀少。因此对天然蓝色素的开发具有较强的市场价值和应用前景。

目前，微生物能够产生的天然蓝色素的类型主要有黄酮类、喹诺酮类、醌类、线性四吡咯生物碱、吩嗪生物碱、吲哚类物质、吡啶生物碱、甘菊蓝、有机金属和金属蛋白；能够产生蓝色素的细菌主要有链霉菌属（Streptomyces）、假单胞菌属（Pseudomonadaceae）、紫色非硫菌属以及节杆菌属等。

尽管许多微生物源色素已进入生产应用阶段，但它们的产量仍然无法满足市场需求。因此必须寻求新的微生物色素来源，通过优化产色素条件、菌株改良、基因工程等手段来降低生产成本，提高色素产量，以替代有毒的合成色素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种成本低、可规模化生产的利用重离子辐照获得高产蓝色素节杆菌的筛选方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种利用重离子辐照获得高产蓝色素节杆菌的筛选方法，包括以下步骤：

⑴将QL17菌株按5%的接种量接种到R2A液体培养基中，在pH=7.0、15℃、160rpm的条件下摇床培养72h，得到QL17菌株发酵液；

⑵将QL17菌株发酵液用质量浓度为0.9%的无菌盐水进行连续稀释，得到稀释度为10^-6的细菌稀释液；

⑶将100μl细菌稀释液移入无菌小皿中，采用中国科学院近代物理研究所HIRFL产生的12C⁶⁺重离子束辐照该细菌稀释液，辐照剂量为500Gy；

⑷选取500Gy辐照条件下菌液涂布于R2A琼脂平板上，挑取单个菌落接种于96孔板和R2A琼脂平板中，15℃培养；每12小时在分光光度计上于590nm处检测吸光度，得到蓝色素产量增高最大的突变体，即为天然蓝色素节杆菌，记作M157。