[发明专利]一种检测α-酮戊二酸和手性2-羟基戊二酸的方法

说明书

一种检测α‑酮戊二酸和手性2‑羟基戊二酸的方法，包括：样品预处理步骤，包括将待测样品与溶剂混合，提取处理，然后浓缩至干，然后加入含有N‑对甲苯磺酰基‑L‑苯丙氨酰氯的溶液以及吡啶，衍生反应后，固液分离，取第一上清液，加入水，再次混匀，固液分离，获得第二上清液；液相色谱‑串联质谱检测步骤，包括采用液相色谱‑串联质谱检测第二上清液，获得检测结果；计算步骤，根据检测结果，计算得到待测样品中α‑酮戊二酸、D‑2‑羟基戊二酸、L‑2‑羟基戊二酸的含量。本发明通过对样品进行手性衍生处理后，在HPLC‑MS/MS平台上，运用MRM检测方法，实现了对该三种物质的快速和精确的测定。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种检测α-酮戊二酸和手性2-羟基戊二酸的方法。

背景技术

α-酮戊二酸(α-KG，α-Ketoglutaric acid，2-Oxoglutaric acid)，CAS号328-50-7，是戊二酸的一种氧化物，即戊二酸α位的酮基化衍生物。它也是一种存在于生物体内的代谢物——是三羧酸(TCA)循环中的中间产物，是谷氨酸脱氨基的酮酸产物，也是最重要的氮素运载体之一，因此，α-KG在脂质合成、氧化应激、蛋白质修饰和细胞死亡等生理过程中具有十分重要的调控作用。

2-羟基戊二酸(2HG，2-Hydroxyglutaric acid，α-Hydroxyglutaric acid)，CAS号2889-31-8，由戊二酸在α位羟基化而来，也是α-KG的还原产物。由于2-羟基戊二酸的α位的碳上连有四个不同的基团，这使得它是一个手性(即旋光性)分子，从而具有两种手性异构体(即光学异构体)——L-2HG(或S-2HG或[-]-2HG，CAS号13095-48-2)和D-2HG(或R-2HG或[+]-2HG，CAS号13095-47-1)。由于生物体内的蛋白质(包括酶)大部分都是具有手性特征的，即拥有不同的三维空间构型，所以L-2HG和D-2HG在生物体内的代谢途径和作用是十分不同的。例如L-2HG被认为是由L-苹果酸脱氢酶(MDH)或在缺氧条件下被乳酸脱氢酶A(LDH-A)由α-KG转化形成，并可被L-2-羟基戊二酸脱氢酶(L2HGDH)转化为α-KG；而D-2HG是由醇酸-酮酸转氢酶(Hydroxyacid oxoacid transhydrogenase，HOT)由α-KG转化而成，并可由D-2-羟基戊二酸脱氢酶(D2HGDH)转化为α-KG。可见它们具有不一样的代谢通路和生物学意义。

常规的检测手段很难区分手性异构体，因为手性异构体在绝大多数的物理和化学性质上都极度相似。但L-2HG和D-2HG的具体含量和比例对一些疾病的诊断具有重要影响，如胶质瘤(在L-2-羟基戊二酸尿症中连续出现明显的高级胶质瘤)和急性髓系白血病(R-2-羟基戊二酸足以促进白血病发生，其作用是可逆的)。因此，一种有效的、可以分别鉴定L-2HG、D-2HG和α-KG的检测方法是十分必需的。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是如何同时检测α-酮戊二酸、D-2-羟基戊二酸和L-2-羟基戊二酸的含量。

一种实施例中提供一种检测α-酮戊二酸和手性2-羟基戊二酸的方法，包括：

样品预处理步骤，包括将待测样品与溶剂混合，提取处理，然后浓缩至干，然后加入含有N-对甲苯磺酰基-L-苯丙氨酰氯的溶液以及吡啶，衍生反应后，固液分离，取第一上清液，加入水，再次混匀，固液分离，获得第二上清液；

液相色谱-串联质谱检测步骤，包括采用液相色谱-串联质谱检测所述第二上清液，获得检测结果；

计算步骤，根据所述检测结果，计算得到待测样品中α-酮戊二酸、D-2-羟基戊二酸、L-2-羟基戊二酸的含量；

所述液相色谱-串联质谱检测步骤中，液相色谱的检测条件中，流动相有流动相A和流动相B组成，其中流动相A为乙酸铵水溶液，流动相B为乙酸铵甲醇溶液。