[发明专利]一种基于CRISPR-Cas9技术特异敲除人兔VEGFA的新型载基因药物

说明书

本发明属于基因药物领域，涉及一种基于CRISPR‑Cas9技术特异敲除人兔VEGFA的新型载基因药物。载基因药物包括药物载体和重组质粒，所述药物载体为一种硫辛酸接枝的聚乙烯亚胺与聚乙二醇的高分子聚合物，所述重组质粒中含有靶向敲除人和兔VEGFA基因的gRNA序列。本发明所制备得药物，在整个观察周期中均具有抑制VEGF表达、阻止视网膜新生血管形成的作用，且一次注药的作用时间至少可维持3个月，与临床用于抗VEGF治疗的药物相比，延长了药物作用时间，减少了注药频率。

技术领域

本发明涉及基因药物领域，尤其涉及一种玻璃体腔注射用、基于CRISPR-Cas9技术、能够特异敲除人兔VEGFA的新型载基因药物。

背景技术

眼底新生血管是糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)和视网膜静脉阻塞(retinal veinobstruction， RVO)等多种眼底血管性疾病的严重并发症，新生血管异常引起的视网膜病变往往会对视力造成不可逆的损害，严重者甚至致盲，它源于现有的血管系统，在缺血、缺氧的环境下被刺激生长，侵入玻璃体腔，最终导致玻璃体积血、牵拉性视网膜脱离和新生血管性青光眼。视网膜新生血管的生成是很多细胞因子和细胞之间相互作用、相互调节的结果，其中包括血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、缺氧诱导因子、胰岛素样生长因子、色素上皮衍生因子、神经粘蛋白等。研究表明，由于视网膜细胞缺血缺氧导致 VEGFA表达增多，进而导致视网膜新生血管的生成。目前，常用的临床治疗方法有视网膜激光光凝术、玻璃体切割手术和玻璃体腔注药术大量研究表明血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是促进视网膜血管生成的主要因素，尤其VEGFA是与新生血管形成最密切相关的一类，因此抗VEGF药物在临床上得到了广泛应用。临床上多采用玻璃体腔注射抗VEGF蛋白类药物或者融合蛋白类药物来治疗视网膜新生血管疾病，以阻止 VEGFA与其受体相结合，从而减少VEGFA的作用，但为了达到预期的治疗效果，患者需要多次进行眼内注药治疗，频繁进行眼内注药会严重增加患者的身体负担和经济负担。因此，许多新兴的抗血管生成药物都在以减少注药频率、减少就诊次数作为研发目的，把长期有效、持续释放或基因治疗作为研发策略。Anne等人以AAV病毒作为药物载体，设计了能够同时表达抗VEGFA microRNA和抗血管生成蛋白色素上皮衍生因子(PigmentEpithelium Derived Factor,PEDF)的载基因药物，用于抑制脉络膜新生血管(choroidalneovascularization,CNV)(Askou A,Alsing S,Benckendorff J,et al.Suppression ofChoroidal Neovascularization by AAV-Based Dual-Acting Antiangiogenic GeneTherapy[J].2019,16:38-50)。他们以激光诱导的CNV小鼠模型作为试验模型，认为这种双效基因药物能够有效抑制 CNV的产生。Egorova等使用包含CXCR4细胞受体配体的模块化多肽载体L1来传递能够靶向VEGFA、VEGFR1和endoglin genes的小干扰RNA，并在CXCR4阳性乳腺癌细胞 MDA-MB-231和内皮细胞中探究这种药物的转染效率，认为这种方法可用于肿瘤抗血管的治疗(Egorova A,Shtykalova S,Maretina M,et al.Synergistic Anti-Angiogenic Effects Using Peptide-Based Combinatorial Delivery of siRNAsTargeting VEGFA,VEGFR1,and Endoglin Genes[J].2019,11(6))，但这些基因类药物尚未能够真正用于临床治疗。