[发明专利]一种体外制备血小板的方法及其培养基

说明书

本发明提供一种通过体外细胞培养体系制备血小板的方法。该方法涉及分离纯化人脐带血，进而得到人类造血干细胞亞群(CD34⁺)，将CD34⁺造血干细胞扩增培养后，置于分化培养基培获得巨核细胞的最高产量，其后将培养基置换为成熟培养基，6‑12天后收集血小板并进行功能检测。本发明可以得到高纯度的CD34⁺造血干细胞，有助于下游巨核细胞的分化；使用优化的培养基，可以得到高产量与纯度的巨核细胞，进而提高血小板分化效率，得到更多的血小板。

技术领域

本发明涉及干细胞分化领域，具体涉及脐带血造血干细胞的分离、纯化、增殖和分化。更具体地，涉及一种体外制备血小板的方法。

背景技术

血小板是血液组成的部份，分化自骨髓当中的巨核细胞。血小板在临床主要用于治疗血液肿瘤疾病，亦可应用于其他肿瘤疾病、败血症、内脏出血等。此外，血小板于再生医疗被广泛应用，有助于伤口复原、组织修护、抑制发炎等，部分眼科疾病亦会使用血小板眼药水进行角膜修护或治疗干眼症。

血小板是巨核细胞成熟后胞质脱落产生的膜状结构，在体外生存期较短，而在骨髓中，巨核细胞的含量极低(占有核细胞的0.01％)，难于大量获得并进行原代培养。因此，可以透过体外培养提高巨核细胞的产量，进而高效率地得到血小板是目前迫切需要解决的问题。

现有技术中，血小板的主要来源为无偿献血与体外细胞培养。前者从血液中离心、压板等程序分离出血小板，然而该技术受限于血液的供给量，且血小板的量取决于原血源，较为不稳定；而后者则可以从iPS细胞技术、脐带血(Samarkanova等，BloodTransfus.2020,18(3):208–216)来制备血小板。iPS细胞技术虽然可以诱导细胞转化为巨核细胞、血小板，但仍需尝试诱导条件，且稳定细胞状态、有效率地取得巨核细胞与血小板会是技术难点，耗时且耗费用。因此，近年国外已有从脐带血制备血小板的技术，并将此技术试图应用于欧洲GMP制程(Good Manufacturing Practice)(Lawrence等，NPJRegen.Med.2021,6:27)。

目前国内脐带血在血液制备应用多用于制备血浆，例如富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)，再从离心血浆提取血小板。因此，现有技术较缺乏生产量高、纯度高、血小板分化效率高的方法。

发明内容

本发明可以透过巨核细胞培养基、血小板成熟培养基，从脐带血造血干细胞稳定制备大量、纯度高的血小板。

为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种体外制备血小板的方法，包括以下步骤：

1)分离出血液样本中的干细胞；

2)于巨核细胞分化培养基中培养；

3)更换为血小板成熟培养基；

4)收集成熟的血小板。

优选地，血液样本为人脐带血。

优选地，上述分离纯化方法为透过磁力分离血液样本中的干细胞。

优选地，上述干细胞为CD34⁺人造血干细胞。

在一优选的实施方案中，巨核细胞分化培养基包含人血小板生成素和干细胞因子。

优选地，巨核细胞分化培养基由SFEM培养基、50-100μg/mL人血小板生成素(humanthrombopoietin,hTPO)、50μg/mL干细胞因子(Stem Cell Factor,SCF)组成。

更优选地，巨核细胞分化培养基包含SFEM培养基、100μg/mL人血小板生成素、50μg/mL干细胞因子组成。

优选地，巨核细胞分化培养基还包含ROCK抑制剂。