[发明专利]一种免疫细胞功能图谱体系及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种免疫细胞功能图谱体系及其构建方法与应用，涉及生物医学技术领域。本发明的免疫细胞功能图谱体系的构建方法基于流式免疫功能评估和单细胞分析技术两种互补方法构建免疫细胞功能图谱体系。本发明的免疫细胞功能图谱体系能够全面、无偏倚、准确、高效地绘制免疫相关疾病的免疫细胞全景图，从单细胞水平上筛选出疾病相关细胞及其功能变化，弥补以往研究的低精度和低通量等缺陷，对各种免疫相关疾病的发病机理探讨、诊断试剂研发、细胞靶向治疗等具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种免疫细胞功能图谱体系及其构建方法与应用。

背景技术

免疫相关疾病是一大类因免疫细胞功能紊乱而累及特定组织、器官或者全身系统的慢性疾病，全球约1/3的人口患病，给社会经济带来巨大负担，是备受关注的公共卫生问题。免疫相关疾病涵盖了强直性脊柱炎、痛风、骨关节炎、骨质疏松等炎症性疾病和类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫病。尽管大多数免疫相关疾病致病机制未明，但是已有多种研究表明，遗传因素、吸烟和肠道菌群等多种环境因素协同作用，通过免疫细胞数量、表型、功能改变介导免疫相关疾病的发生。免疫细胞作为有机体免疫功能执行单元，是清除外来病原体和内源性致病物质的卫兵，在免疫相关疾病研究领域中备受关注。全基因组关联研究基于免疫芯片鉴定了自身免疫疾病易感位点，这些位点功能注释的基因多涉及T细胞、NK细胞、B细胞等多种免疫细胞功能及TNF通路、IL23-IL17通路等多种免疫通路。以往基于流式细胞术、基因芯片和测序技术等研究提示，多种免疫相关疾病固有免疫细胞和适应性免疫细胞发生了致病改变：如Th1/Th2失衡，Treg功能受损或者数量减少，自身反应B细胞分泌大量自身抗体，NK细胞功能改变等。但是以往研究由于技术局限性，缺少对免疫细胞全景的完整描述，忽略了细胞自身可塑性和细胞间的异质性，缺少能够应用于疾病诊治的细胞靶标。

研究发现，基于流式细胞术的免疫功能评估，从经典免疫细胞表面和细胞内标志性蛋白出发，设计了一套同时检测多种经典分型免疫细胞功能的多荧光panel，从而捕获经典免疫细胞的相对丰度和功能变化。但是该方法的不足在于人为分类导致选择偏倚、以及只能反映panel纳入的部分分子标志物水平等。而单细胞分析技术作为近年来新兴的生物技术之一，能够无偏倚地从单细胞水平上和从转录组、蛋白组、免疫组库等多个维度解读生理和病理状态下细胞异质性和分化命运等，捕获未知的罕见细胞类型，从而弥补传统流式细胞术分析的多种不足。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种免疫细胞功能图谱体系的构建方法及其构建方法与应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种免疫细胞功能图谱体系的构建方法，包括以下步骤：

(1)设置疾病组与对照组，并分别取疾病组和对照组相同种类的标本待用；

(2)对疾病组与对照组标本进行单细胞悬液分离，得单个核细胞；

(3)取步骤(2)的单个核细胞进行单细胞分析，得到单细胞分析结果；

(4)取步骤(2)的单个核细胞进行流式免疫功能评估，得到流式细胞图谱；

(5)对步骤(3)得到的单细胞分析结果和步骤(4)得到的流式细胞图谱进行分析，构建免疫细胞功能图谱体系。

本发明的免疫细胞功能图谱体系的构建方法，基于单细胞分析技术筛选疾病特异标志物，并基于特异标志物设计流式抗体panel实现常规流式检测的互补方法构建免疫细胞功能图谱体系，从而解决免疫相关疾病临床诊治问题的不足。

作为本发明所述的构建方法的优选实施方式，所述步骤(3)中的单细胞分析具体包括以下步骤：

(1)构建单细胞cDNA文库；

(2)利用Illumina平台对单细胞cDNA文库进行测序；

(3)对测序数据进行拼接和质控，转换为fastq文件；