[发明专利]一种植物组织产IAA内生菌高通量筛选方法

权利要求书

1.一种植物组织产IAA内生菌高通量筛选方法，包括以下步骤：

1)获得植物组织样本微生物菌悬液

将采集到的健康生长的农作物组织样品清洗干净、外部杀菌消毒，室温下用活性释放型缓冲液超声处理20～50s，过滤收集过滤液，获得植物组织悬浮液，保存于2～7℃保存备用；

超声条件为同时采用三种不同频率的超声波进行处理，所述超声波频率分别为20～40KHz、40～50KHz、80～100KHz；

所述活性释放型缓冲液包含氯化铵：0.2-0.7g/L，磷酸氢二钾：0.4-1.0g/L，磷酸二氢钾：0.3-0.6g/L，MgSO₄-7H₂O：0.6-1.2g/L，CaCl₂-2H₂O：0.1-0.5g/L，FeSO₄-7H₂O：2-8mg/L，ZnSO₄-7H₂O：50-150ug/L，MnCl₂-4H₂O：15-45ug/L，硼酸：100-500ug/L，CoCl₂-6H₂O：100-400ug/L，CuCl₂-2H₂O：5-15ug/L，NiCl₂-6H₂O：15-30ug/L，KCl：2-3mM，3-7wt％小微球藻多糖，pH为7.2-7.4；

2)确定分离培养最适稀释浓度

将植物组织悬浮液加入高通量分离液体培养基中，分别梯度稀释植物组织稀释液，在无菌操作下将各梯度稀释液分别移入不同的细胞培养板孔内培养，另取未添加植物组织悬浮液的5～15％TSB溶液为阴性对照，每个梯度设三个以上重复，将96孔细胞培养板封口放置于摇床上，28～37℃，80～180r/min培养2-10天；

96孔细胞培养板内有20～35％的孔内呈现肉眼可见浑浊状态，该96孔细胞培养板对应的植物组织稀释液浓度作为分离培养的最适稀释浓度；

所述高通量分离液体培养基包含有50～150mg/L的L-色氨酸，10～30g/L酪蛋白多肽，10～30g/L大豆蛋白多肽，2-7g/L氯化钠，磷酸氢二钾：0.5-1.0g/L，磷酸二氢钾：0.3-0.7g/L，MgSO₄-7H₂O：0.6-1.3g/L，CaCl₂-2H₂O：0.1-0.3g/L，FeSO₄-7H₂O：2.0-5.0mg/L，ZnSO₄-7H₂O：50-150ug/L，MnCl₂-4H₂O：20-50ug/L，硼酸：200-400ug/L，CoCl₂-6H₂O：100-300ug/L，CuCl₂-2H₂O：5-15ug/L，NiCl₂-6H₂O：10-30ug/L，Na₂MoO₄-2H₂O：40-60mg/L，甲醇：2-7ml/L，1.0-3.5mM豆蔻酸钾，独脚金内酯2-5wt％，茉莉酸甲酯0.5-1wt％，PH为6.0-8.0；

3)筛选产IAA单一菌株；

在无菌操作下将最适稀释浓度的植物组织稀释液移入细胞培养板孔内，将细胞培养板封口放置在摇床上，28～37℃，80～180r/min培养培养2～10天；培养完成吸取细胞培养板孔内的浑浊菌液于白色陶瓷板，加入alkowski显色液进行显色反应，同时以IAA标准液作为阳性对照；未添加组织样本匀浆液的高通量分离液体培养基溶液为阴性对照；

白色陶瓷板于室温，避光条件下放20～40min后观察，颜色变红者表示菌株能够产生IAA；根据IAA显色反应的结果对产IAA的细胞培养板中的菌株进行实验室编号并甘油保藏。

2.根据权利要求1所述的植物组织产IAA内生菌高通量筛选方法，其特征在于，步骤1)中，超声处理时间为20～50s。