[发明专利]一种植物组织产IAA内生菌高通量筛选方法

说明书

一种植物组织产IAA内生菌高通量筛选方法，本方法从新鲜植物植物组织中利用低、中和高三种频率超声波共同处理，增加植物植物组织内生菌释放出来的种类及数量，增加了植物组织内生菌的获得。随后利用96孔板高通量分离培养细菌，使用梯度稀释的方法增加获得单一细菌的比例。本发明采用双向同步进行IAA显色反应和菌种保存，高通量筛选产IAA组织内生菌菌株，为植物组织内生菌的功能及与植物的互作研究提供更好的菌种资源。使获得单菌株的获得率提升至100％，不需要常规平板划线纯化菌株，大大提高筛选效率。

技术领域

本发明属于环境微生物学技术领域，具体涉及一种植物组织产IAA内生菌高通量筛选方法。

背景技术

植物微生物组由栖息在不同植物组织和器官(如种子、根、茎、叶、花和果实)中种类繁多的微生物组成。这些微生物群落作为附生生物存在于外部，作为内生生物存在于植物的内部组织和器官，影响植物的活力和健康。在这些微生物群落中，内生菌是生活在寄主植物内的微生物，不引起任何疾病症状或负面影响，并且具有拮抗植物病原体的能力。内生菌通过影响宿主植物的生理和发育过程，在宿主植物的运作中发挥了重要作用。众所周知，内生细菌通过释放抗菌代谢物、合成植物激素、铁载体、与病原体竞争空间和养分以及调节植物的抗性反应，参与赋予宿主植物对各种生物和非生物压力的耐受性或抗性。由于有益微生物作为植物生长促进剂和控制植物病原体的生物防治剂的应用，因此对植物内生微生物相互作用的研究至关重要。内生微生物是减少农药和化肥使用的可能替代物。与宿主相关的内生细菌是开发控制植物病原体的生物防治剂的有用工具。细菌内生生物的组成因植物、组织、器官、基因型、品种、土壤和位置等的不同而不同。

植物组织内生菌组的研究正在进入快速发展期，下一阶段必然着重研究植物组织内生菌组在植物中的功能，并逐渐揭示植物与植物组织内生菌组互作过程的分子机制。

植物中最活跃的生长素是吲哚-3-乙酸(IAA)。IAA是最通用和必需的代谢物，在细胞伸长、顶端优势维持、防止细胞衰老方面诱导植物生长和解剖学改善，还能调节植物组织的生长发育。IAA在植物与微生物的互作中作为一种效应分子，在地上部分，它能加强光合作用、色素合成及种子、花、果实和叶子的早期和延迟生长过程。IAA能影响植物的细胞分裂、根瘤的形成、种子的播种和块茎的萌发、木质部和根的发育、光合作用，也能增加植物对各种压力条件的抗性。

目前，阻碍植物组织内生菌功能及植物与微生物互作研究的关键因素是植物组织内生菌资源。尽管国际储备中心已经存储了成千上万的微生物，但这些微生物来自于多种环境和物种。微生物在特定生态位的定殖能力很可能在不同栖息地和不同物种根部产生分化，因此有必要从给定的植物组织中分离培养原位的微生物，为植物组织内生菌的功能及与植物的互作研究提供更好的菌种资源。

目前微生物菌株筛选的方法主要通过平板稀释法对植物组织内生菌进行分离筛选：

中国专利202110634318.5公开了“一种促进通关藤生长的内生菌筛选方法”；中国专利201980013968.9公开了“内生菌筛选”；以上两项专利中所述的内生菌获得方法需要进行多次培养，且需要划线纯化菌株从而获得单一纯菌株。获得的菌株在进行功能验证，整个筛选过程周期长且操作繁琐。

中国专利202122887945.8公开了“一种Salkowski法定性筛选分泌IAA 菌株的装置”，该实用新型专利要求书主要是反应板和遮光罩装置，实现多样本同时实验并能有效起到遮光作用，防止光的存在影响Salkowski法检测过程中的显色反应。

原位分离培养微生物对于揭示微生物在植物生长和健康中的功能非常重要。分离培养的微生物和无菌体系相结合，推动植物组织内生菌组从描述向功能研究发展的重要技术。

发明内容