[发明专利]一种用于等位基因多态性分型的引物设计方法及其应用

说明书

本发明公开了一种用于等位基因多态性分型的引物设计方法及其应用，属于分子生物学技术领域，所述引物设计方法包括如下步骤：S1、根据待检测目的基因序列，设计特异性引物序列和荧光探针序列；S2、将一段和所述荧光探针序列完全或部分相同、并且和待检测目的基因序列不匹配的tag序列添加到所述特异性引物序列的内部，即可得到用于等位基因多态性分型的引物。本发明将一段和荧光探针序列完全或部分相同、并且和待检测目的基因序列不匹配的tag序列设计在用于等位基因多态性分型的引物(ASP)内部，所述引物不仅能高效完成待检测目的基因的分型鉴定，还够有效改善AS‑PCR反应中所述引物和非匹配基因型模板之间发生的错配情况。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于等位基因多态性分型的引物设计方法及其应用。

背景技术

等位基因多态性(Allelic Polymorphism，AP)广泛存在于各物种基因组中并与各种性状相关联，因此AP分型检测被广泛用于遗传疾病诊断，药物开发使用，作物育种以及品种纯度鉴定等领域。AS-PCR是用于AP分型的主要技术手段，通过设计三条引物，两条ASP仅在3＇末端碱基存在差异(分别和对应的多态性位点互补)，共用一条等位基因通用反向引物(Locus Specific Primer，LSP)，在同一反应体系中进行PCR反应产生在AP位点存在差异的两种产物，通过鉴别这两种产物是否存在以完成样品的AP分型鉴定。使用基于荧光信号的AS-PCR进行AP分型检测具有准确，快速，高通量，低成本，无污染，设备要求低及易操作的优势。

由于荧光染料和双链DNA的无差别结合导致非特异扩增产物难以区分，基于荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)原理设计的荧光探针被广泛用于AS-PCR中。当荧光基团和猝灭基团足够靠近(100A)的时候，荧光基团受激发产生的发射光被猝灭基团吸收，进而以更长波长的光或热能形式发散，因此检测不到荧光光基团的荧光信号。当两个基团被分隔开，荧光基团的发射光无法被猝灭基团吸收，从而被检测到。基于此原理主要有三种荧光探针被设计使用：

第一种是较为简单的Taqman探针(US 1994/5538848 A中公开)，其是一段长度不超过30bp的核苷酸序列，该探针序列和目标PCR产物中间区段互补，两端分别标记荧光基团和猝灭基团，该长度下荧光基团的发射光被猝灭基团吸收导致荧光信号处于猝灭状态。当存在目标PCR产物时，探针和目标产物结合，在下一轮PCR反应中，扩增引物延伸至探针结合区时，DNA聚合酶(如Taq酶)的5＇-3＇核酸外切酶活性将荧光基团或猝灭基团从探针上切下，导致二者分离产生荧光信号。Taqman探针被用于开发单核苷酸多态性(Single NucleotidPolymorphism,SNP)分型工具—Taqman Assay(K.J.Livak Allelic discriminationusing fluorogenic probes and the 5'nuclease assay.Genetic Analysis:Biomolecular Engineering.1999；14:143-9)并被广泛使用。Taqman Assay是将待检测SNP位点设计于探针序列中，不同的SNP位点使用不同的荧光基团。由于DNA聚合酶切割荧光探针依赖于荧光探针和目标PCR产物的完全结合，因此一种SNP基因型只会产生对应的荧光探针信号，从而完成分型鉴定。

第二种是Amplifluor探针(I.A.Nazarenko et al.A closed tube format foramplification and detection of DNA based on energy transfer.Nucleic AcidsResearch.1997；25:2516-21.)，该探针的5＇端设计为茎环结构，荧光基团和猝灭基团由于分别标记在茎端，因此互相靠近而导致荧光猝灭。探针3＇端则是引物序列，探针通过引物序列参与PCR反应，在延伸过程中，荧光基团和猝灭基团相互分离产生荧光信号进而检测目标PCR产物是否存在。