[发明专利]恒温环型核酸扩增法引物组及以其扩增核酸的方法

说明书

一种LAMP引物组，包括FIP、BIP、F3、与B3之原始LAMP引物，以及至少一自主引物。原始LAMP引物靶向核酸上的区域F3、F2、F1C、B1C、B2、及B3，且区域F3、F2、F1、B1C、B2C、及B3C在核酸之一顺向链的5’端往3’端依序排列。引物FIP包括靶向区域F1C及F2的寡核苷酸，且引物BIP包括靶向区域B1C及B2的寡核苷酸。至少一自主引物靶向的一区域位在从F3到B3的区域之外。

【技术领域】

本案系关于一种恒温环型核酸扩增法(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)引物组，尤指一种具有额外自主引物的LAMP引物组。

【背景技术】

恒温环型核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)自2000年初由日本荣研化学公司(Eiken Chemical Co.Ltd)的Notomi等人公开以来，因其具有简单、专一、灵敏、且快速等优点，而被广泛用于快速诊断植物病原体或传染病病原体的测定开发中，尤其是在即时现场设置(field settings)中。由于LAMP设计了靶向(targeting)待测核酸的六或八段独特序列的四个或六个特异性引物，因此提高了其特异性。

图1显示LAMP设计的原始引物示意图。四个为一组的LAMP原始引物包括F3、B3、FIP、及BIP。FIP(forward inner primer)及BIP(backward inner primer)称为内部引物，每一个都由两个引物头尾相连或由一个TTTT连接子相连所组成。这四个引物靶向六个区域，即目标模板上的区域F3、F2、F1C、B1C、B2、及B3。区域F1C及B1C的解链温度(meltingtemperatures，Tms)高于区域F2及B2，而区域F2及B2的解链温度又高于区域F3及B3，以确保引物FIP及BIP比引物F3及B3的退火(annealing)速度更快且扩增更早。引物F3及B3为置换引物(displacement primer)，其扩增将置换引物FIP及BIP所产生的扩增子(amplicon)，并作为循环扩增步骤的模板。四个LAMP引物的扩增方向在图1中以黑色箭头表示。

与大多数基于聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction,PCR)的检测分析相比，LAMP因使用更多引物数量及更高引物浓度的特殊设计与工作机制而可提供更高的灵敏度。由于具有特殊引物设计且利用具有链置换活性(strand-displacement activity)的聚合酶，使得LAMP可通过自我引发(self-priming)来进行等温扩增。LAMP在恒温下进行，通常为60-65℃，而这取决于所使用的聚合酶，因此可以无需使用热循环仪。此外，阳性检测通常可在30分钟内完成，并且可以通过比色法或浊度进行目视检测。综合而言，LAMP是一种理想的核酸扩增及检测技术，可满足WHO对即时照护(point-of-care)/即时需求(point-of-need)检测的要求。

虽然与大多数基于PCR的扩增方法相比，LAMP被认为具有更高的灵敏度，但低灵敏度仍可能是一个问题，因为反应温度在60-65℃的范围通常不足以使目标变性，尤其是那些具有高GC含量(GC-content,guanine-cytosine content)及/或强二级结构的目标。有时可通过挑选不同的LAMP引物组来解决某些引物性能不佳的问题，因此通常的做法是挑选几组候选引物再从中筛选具有较佳检测灵敏度的引物。此外，也可通过反应优化(reactionoptimization)来提高灵敏度，而反应中涉及的所有因素都可以是待优化的潜在因素，例如反应温度，聚合酶类型，酶量，引物、dNTP、及镁离子的浓度，以及反应促进添加剂的使用，例如二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)及甜菜碱(betaine)。