[发明专利]快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA-LFD引物、方法和试剂盒

权利要求书

1.一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA-LFD引物，由正向引物和反向引物组成，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.根据权利要求1所述的RPA-LFD引物，其特征在于，所述的反向引物的5′端用生物素Biotin标记。

3.一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA-LFD探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

4.根据权利要求3所述的RPA-LFD探针，其特征在于，探针的5’端标记了FAM或FITC荧光基团，3’端用C3Spacer封闭。

5.一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA-LFD试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包含权利要求1或2所述的RPA-LFD引物和权利要求3或4所述的RPA-LFD探针。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还含有浓度为280mM的醋酸镁溶液和反应缓冲液Rehydration Buffer、拥挤剂Carbowax 20M、dNTPs、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、重组酶蛋白、单链结合蛋白、DNA聚合酶和RPA-LFD核酸检测试纸条。

7.一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA-LFD方法，其特征在于，包含以下步骤：

1)提取样本核酸；

2)以提取的核酸为模板，用权利要求1或2所述的引物，以及权利要求3或4所述探针进行RPA反应；

3)将上述反应得到的RPA反应产物用无菌水稀释，得到稀释液；

4)将稀释液滴在RPA-LFD核酸检测试纸条上，确定样品中是否含有东方蜜蜂微孢子虫；其中，RPA-LFD核酸检测试纸条可检测RPA反应产物是否携带荧光标记和生物素Biotin标记。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(2)中的RPA反应体系为：RehydrationBuffer 29.5uL，20umol/L的权利要求1或2所述的RPA-LFD引物中的正向引物和反向引物各2.1uL，10umol/L的权利要求3或4所述的RPA-LFD探针0.6uL，样本核酸2.0uL，280mM醋酸镁2.5uL，H₂O补至50uL。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的RPA反应条件为：39-42℃反应20-30min。