[发明专利]快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA-LFD引物、方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的RPA‑LFD引物、方法和试剂盒，该引物序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成，该探针序列如序列表中序列5所示。本发明准确性高、特异性好、重复性好、可以准确、快速地进行检测，反应结果易于观察，通过试纸条的红色条带即可判读；灵敏度高；特异性好，适用于蜂场的现场检测等，具有极高的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA-LFD引物、方法和试剂盒。

背景技术

东方蜜蜂微孢子虫病的病原属于微孢子虫科(Nosematidae)微孢子虫属(Nosema)的成员，被命名为东方蜜蜂微孢子虫。东方蜜蜂微孢子虫属于单细胞真核生物，不能在宿主细胞外繁殖，没有经典的线粒体，但携带有由线粒体衍生的细胞器，称为线粒体残迹，通过利用宿主的能量物质完成自身的快速繁殖。东方蜜蜂微孢子虫具有感染蜂种多、范围广的特点。

对蜜蜂孢子虫病病原的检测方法有，通过拉取蜜蜂中肠，然后用普通光学显和相差显微镜观察孢子虫(根据孢子大小)，以超微结构中的极丝的螺旋数、直径和孢子大小。用流式细胞仪定量检测活性孢子；用普通PCR和qPCR检测感染率。在养蜂生产中，根据观察蜜蜂感染后的中肠的病变形态等临床症状及用光学显微镜方法诊断，结果均相对滞后且不可靠、检测率低；电镜鉴定方法需要较高的专门操作技术和精密仪器，PCR检测也需要昂贵的仪器且检测的时间较长。现有的东方蜜蜂微孢子虫检测方法由于上述缺陷无法满足疫病现场诊断的需求。研发适合用于东方蜜蜂微孢子虫现场诊断的技术对于有效控制东方蜜蜂微孢子虫流行具有重要意义。

重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种很有前途的等温核酸扩增技术，它依赖于重组酶，单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶的组合，在37到42℃的恒定温度下进行20～30min的DNA扩增。该技术依赖重组酶介导引物与目标片段序列结合，使核酸扩增反应脱离了传统PCR反应必须经历的变性、退火和延伸的热循环步骤，进一步触发聚合酶对目标片段进行指数扩增。最佳反应温度在37℃-42℃，反应速度快，10-20分钟即可获得可检出水平的扩增产物。针对RPA扩增产物的检测，实时荧光RPA可对扩增反应进程实时监控，但需要能激发并检测荧光基团的恒温仪器，比如可控温酶标仪或荧光PCR仪；相比而言，试纸条RPA对硬件条件要求更低，只需完成控温扩增反应，随后通过侧向流层析试纸条读取试验结果。因此，试纸条RPA更适合于现场检测的应用。目前，东方蜜蜂微孢子虫检测过程对仪器设备具有依赖性，且无法做到现场快速检测。因此，建立一种快速可靠的诊断方法对东方蜜蜂微孢子虫的预防和控制具有重要的意义。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种能够实现现场快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA核酸等温扩增引物。

本发明还提供了含有上述快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA恒温扩增引物的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明提供的一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA-LFD引物，由正向引物和反向引物组成，其核苷酸如下所示：

正向引物NC-RPA-F:

5’-ATTGTAGTTCCAGCAGTAAACTATGCCGACG-3’(SEQ ID NO：3)；反向引物NC-RPA-R:

5’-biotin-GCCGCACAATCCACTCCTTGTGGTATTCTTCC-3’(SEQ ID NO：4)。

本发明提供的一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA-LFD探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，探针的5’端标记了FAM或FITC荧光基团，3’端用C3Spacer封闭。

在本发明的一个具体的实施方式中，探针的核苷酸序列如下所示：

NC-RPA-P：