[发明专利]白菜型油菜Bra040707基因在干旱胁迫中的应用

权利要求书

1.白菜型油菜Bra040707基因在提高白菜型油菜耐干旱胁迫能力中的应用，其特征在于：包括以下步骤：

S1：选用白菜型油菜、pCAMBIAsuper1300-EGFP载体、大肠杆菌DH5α以及农杆菌GV3101作为实验对象；

S2：将新鲜的白菜型油菜叶片立即放入液氮，提取白菜型油菜总RNA，合成cDNA第一链；

S3：获取Bra040707基因核苷酸序列，设计引物，在上游引物5'端加上内切酶PstI及保护碱基，在下游引物5'端添加内切酶KpnI及保护碱基，形成F2和R2引物，用所述引物扩增目的片段并进行琼脂糖凝胶电泳，回收所述目的片段；

S4：将表达载体pCAMBIAsuper1300-EGFP进行内切酶PstI和内切酶KpnI的双酶切，将胶回收的所述目的片段与表达载体pCAMBIAsuper1300-EGFP用2× Universal Ligation Mix进行连接,获得过表达白菜型油菜Bra040707基因的表达载体；

S5：将所述表达载体转化大肠杆菌DH5α，37℃下倒置培养12 h后，进行测序验证；

S6：将测序正确的所述表达载体转化农杆菌GV3101，挑取单克隆在试管中摇菌24 h，之后转大摇：将菌液接种入100 mL含 Kana和Rif抗生素的YEB培养基中，继续摇菌至OD₆₀₀ =0.8-1.0，所述Kana的浓度为100μg/mL，所述Rif的浓度为50μg/mL；

S7：将培养好的菌液分装于50 mL离心管中，在室温下以5000 rpm转速离心10分钟，弃去上清液，用配好的重悬液对50 mL离心管中沉淀的菌体进行重悬浮，并用所述重悬液调整菌液浓度至OD₆₀₀ = 0.8-1.0；所述重悬液的配置方法为含5％蔗糖的1/2 MS液体培养基，加入50 mg/L的乙酰丁香酮AS，并加入0.02％表面活性剂Silwet L-77；

S8：对白菜型油菜花苞浸染步骤S7得到的菌液；

S9：过表达白菜型油菜Bra040707基因的白菜型油菜的筛选和鉴定；

S10：对干旱胁迫下的所述转基因白菜型油菜的表型及抗旱能力分析，

所述Bra040707基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的白菜型油菜Bra040707基因在提高白菜型油菜耐干旱胁迫能力中的应用,其特征在于：所述步骤S3中，所述引物F2和R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5-6所示。

3.根据权利要求1所述的白菜型油菜Bra040707基因在提高白菜型油菜耐干旱胁迫能力中的应用,其特征在于：所述步骤S5中，测序验证的方法为选取单克隆菌落摇菌、提质粒，在载体上目的片段插入位置的两端设计引物，PCR验证目的基因是否成功连入载体，并对重组质粒进行测序验证。

4.根据权利要求1所述的白菜型油菜Bra040707基因在提高白菜型油菜耐干旱胁迫能力中的应用,其特征在于：所述步骤S8中浸染方式包括：用镊子将每个花苞拨开一个开口，把花序逐次浸入菌液中20秒，期间晃动在菌液中的花序，浸染完成后用清水喷洒花序并完成套袋，完成套袋后把浸染过的植株避光24 h，24 h后恢复正常培养条件，五天之后，对新出现的待开花苞拨开小口，并把不适合浸染的花苞去除，然后按照同样的浸染方式进行第二次浸染。