[发明专利]白菜型油菜Bra040707基因在干旱胁迫中的应用

说明书

本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体而言，涉及白菜型油菜Bra040707基因在提高白菜型油菜耐干旱胁迫能力中的应用。利用白菜型油菜Bra040707基因第二个外显子上的354 bp片段以及pHELLSGATE 12载体构建了Bra040707基因的RNAi载体，利用白菜型油菜（菜心45）Bra040707基因的2466 bp以及pCAMBIAsuper1300‑EGFP构建了OE载体。通过构建含该基因片段的RNAi载体和OE载体，并通过转基因技术将该基因片段转入白菜型油菜，能有效地增强白菜型油菜的干旱胁迫耐受性，并表明白菜型油菜Bra040707基因能够作为白菜型油菜抗旱的正调控因子。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体而言，涉及白菜型油菜 Bra040707基因在干旱胁迫中的应用。

背景技术

干早胁迫是指植物能够吸收的水分远低于生存所需要的水分时，导致了植物体内水分亏缺，胁迫时间增加会导致水分过度亏缺，最终会造成植物的死亡。

RNA干扰是由双链RNA诱导产生的基因沉默现象，它可以在转录水平和转录后水平发挥作用，与靶基因序列同源的小片段干扰RNA，高效和特异性地使mRNA 降解，从而导致内源靶标基因的沉默，最终产生相应功能的表型缺失。自RNAi 现象发现以来，RNAi技术被广泛运用于植物遗传改良及作物育种，且取得了重大进展。

多年来对DEAD-box解旋酶的研究发现，很多DEAD-box解旋酶基因不仅使植物只对单一的胁迫具有耐受性，而且还参与对多种胁迫的响应，有的基因通过正向调控促进植株的生长发育增强植物对逆境的耐受性，有的是通过负向调控表现出植物对不同胁迫的敏感性。目前，已经证明DEAD-box解旋酶在多种植物中具有抗逆性，其中对于干旱和盐胁迫的研究较为广泛。利用基因工程来提高植物的抗逆性和生产力是非常理想的，DEAD-box解旋酶Bra040707基因可作为不同抗逆性植物的候选基因。

而白菜型油菜是我国的原产蔬菜，种类繁多，营养丰富，是日常一种主要的叶菜类蔬菜，其也经常深受干旱胁迫的影响。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供白菜型油菜Bra040707基因在干旱胁迫中的应用。

本发明采用的技术方案为：

白菜型油菜Bra040707基因在干旱胁迫中的应用，包括以下步骤：

S1：选用白菜型油菜、pHELLSGATE 12RNAi载体、pCAMBIAsuper1300-EGFP 载体、大肠杆菌DH5α以及农杆菌GV3101作为实验对象；

S2：将新鲜的白菜型油菜叶片立即放入液氮，提取白菜型油菜总RNA，合成 cDNA第一链；

S3：获取Bra040707的参考序列，在第二个外显子上设计产物为354bp的引物，在引物5'端加上pHELLSGATE 12RNAi载体的接头序列，形成F1和R1引物，用该引物扩增目的片段并进行琼脂糖凝胶电泳；

S4：将目的片段进行胶回收，连接pHELLSGATE 12载体，在25℃的环境温度下保存2小时之后加入1μL的K蛋白，然后在37℃的环境温度下反应10分钟；

S5：获取Bra040707的参考序列为2469bp，在参考序列上设计产物为2466 bp的引物，所述引物不包含终止密码子TAG，在前后引物5'端分别加上内切酶 PstI及保护碱基，后引序列添加内切酶KpnI及保护碱基，形成F2和R2引物，用该引物扩增目的片段并进行琼脂糖凝胶电泳；

S6：将表达载体pCAMBIAsuper1300-EGFP进行内切酶PstI和内切酶KpnI 的双酶切，将胶回收的目的片段与表达载体pCAMBIAsuper1300-EGFP用2× Universal LigationMix进行连接；