[发明专利]在基质上使用具有间隙的挂锁对来自组织的基因进行空间测序的方法

说明书

本发明涉及在基质上使用具有间隙的挂锁对来自组织的基因进行空间测序的方法。具体而言，本发明涉及获得包含至少一条m‑RNA链的样品中的靶序列的空间定位和序列信息的方法。

技术领域

本发明涉及用于在组织上在亚细胞水平上获得基因的测序和空间信息的方法。

背景技术

在组织上在亚细胞水平上通过保持空间信息检测所有表达的基因和随后对于潜在的变体来测序那些基因已为具有挑战性的。尤其具有挑战性的是达到亚细胞分辨率。此申请中描述的方法允许低至数十纳米的理论分辨率并允许将组织上的空间信息与所表达基因的测序信息相联系。

此技术由Spatial Transcriptomics和10X genomic公司开发。在此，由于用预先点标在阵列上的空间标识符给组织RNA分子加标签，因而空间信息得以维持。稍后，通过在例如Illumina上的标准体外NGS测序方法对所得文库进行测序。通过点标的过程，空间标识符在阵列上的位置在测序过程发生之前已知。在空间标识符的测序后，可将连接的感兴趣的RNA序列分配至组织定位。此方法的一个主要限制为该技术的分辨率，由于其依赖于目前仅在多细胞水平上的阵列上斑点的特征尺寸。Spatial Transcriptomics具有多件授权的专利，然而分子被条形码标记且在基质外进行测序。对所有收集的带条形码的分子进行文库制备也是必要的。在此呈现的方法并不将分子从基质上移除，而是直接在基质上确定序列。参考文献为：US20150344942A1 METHODS AND PRODUCT FOR OPTIMISING LOCALISED ORSPATAL DETECTION OF GENE EXPRESSION IN A TISSUE和WO2016162309A1 SPATIALLYDISTINGUISHED, MULTIPLEX NUCLEIC ACID ANALYSIS OF BIOLOGICAL SPECIMENS。

结合遗传和空间信息的另一种方法公开于WO2012/140224、Fredrik Salmén等人在Nature protocols 2018 “Barcoded solid-phase RNA capture for SpatialTranscriptomics profiling in mammalian tissue”中和Sanja Vickovic等人，“High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling”, Naturemethods, 2019年9月9日。

发明内容

所描述的方法目前被用于检测组织上的mRNA，其具有300-500 nm的高空间分辨率，相较于目前市场上其他竞争方案具有简化的工作流且无需空间标识符。

因此，本发明的目的为获得包含至少一条m-RNA链的样品中的靶序列的空间定位和序列信息的方法，其包含以下步骤：

a. 提供具有能够与至少一条m-RNA链结合的数个间隔单元和具有至少一个基准标记物的表面

b. 向该表面提供包含至少一条m-RNA链的样品，其中该样品的至少一条m-RNA链与至少一个间隔单元结合，产生至少一种单链寡聚物

c. 拍摄该表面的第一图像，以获得该样品相对于基准标记物的空间信息

d. 将样品从表面移除

e. 将至少一种包含50 - 1000个核苷酸的寡核苷酸用其5’和3’末端与单链寡聚物的互补部分进行杂交，从而形成挂锁形状的结构，该结构被连接以产生单链环状模板

f. 通过能够滚环扩增的聚合酶将单链环状模板扩增成数个DNA多联体(concatemer)，从而形成rolony

g. 获得该rolony的序列信息

h. 将样品的空间信息与rolony的序列信息相联系。