[发明专利]一种Bacillomycin D高活性菌株及其构建方法和应用

权利要求书

1.重组菌，其特征在于，为提高解淀粉芽孢杆菌的抗菌脂肽Bacillomycin D产量得到的重组菌，所述重组菌包含解淀粉芽孢杆中IturinA合成酶操纵子硫酯酶（TE）基因；出发菌株为解淀粉芽孢杆菌fmbJ，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）fmbJ，由南京农业大学酶工程实验室自主筛选所得，菌种保藏号为CGMCC No.0943；

提高抗菌脂肽Bacillomycin D产量的方法如下：将Bacillomycin D合成酶操纵子中的硫酯酶结构域替换成Iturin A合成酶操纵子中的硫酯酶结构域；所述替换通过同源重组实现；

所述重组菌的构建方法包括如下步骤：

（1）设计引物对IA-U-F和IA-U-R、IA-D-F和IA-D-R、IA-TE-F和IA-TE-R；以解淀粉芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板，PCR扩增上游同源臂IA-U、下游同源臂IA-D；以解淀粉芽孢杆菌LZ-5基因组DNA为模板，PCR扩增Iturin A合成酶操纵子中的硫酯酶结构域IA-TE；

（2）以IA-U-F和IA-TE-R为引物，上述（1）中获得的IA-U和IA-TE为模板，通过重叠延伸PCR获得融合片段IA-U-TE；

（3）以IA-U-F和IA-D-R为引物，上述（1）中获得的IA-D和（2）中获得的IA-U-TE为模板，再次重叠延伸PCR获得融合片段IA-U-TE-D；

（4）设计引物对Linear-pKS2-F和Linear-pKS2-R，以消除BamHI限制性酶切位点的温敏型质粒pKS2-DBamHI为模板，PCR扩增获得线性载体Linear-pKS2；

（5）用ClonExpress II One Step Cloning Kit中的重组酶将融合片段IA-U-TE-D和线性载体Linear-pKS2连接成重组整合质粒pKS2-IA-TE；

（6）将重组整合质粒pKS2-IA-TE转入解淀粉芽孢杆菌fmbJ中，通过温度诱导同源重组双交换，将目的基因IA-TE整合至基因组中，抗性筛选和测序验证，获得产Bacillomycin D的高活性菌株，命名为解淀粉芽孢杆菌fmbJ-IA-TE；

步骤（1）所述的引物对序列如下：

IA-U-F：TATAGGGCGAATTGGGTACCGACGAGGGCAGAAGCAACAT；

IA-U-R：TCGAAAACGGCCGCTTGAATGGCGCGTGCCATTGT；

IA-D-F：ACGGATTGAAGAACGGCATCATCACGGACT；

IA-D-R：GCTTATCGATACCGTCGACCTGCCGGATCAAAAAGCCA；

IA-TE-F：ATTCAAGCGGCCGTTTTCGAA；

IA-TE-R：GATGCCGTTCTTCAATCCGTTTAATAATAGATCGAAT；

步骤（4）所述的引物对序列如下：

Linear-pKS2-F：GGTCGACGGTATCGATAAGCTT；

Linear-pKS2-R：GGTACCCAATTCGCCCTATAGTG；

步骤（4）所用的消除BamHI限制性酶切位点的质粒pKS2-DBamHI是对原始的质粒pKS2进行定点突变获得。

2.权利要求1所述的重组菌在抑制黄曲霉菌中的应用。