[发明专利]一种Bacillomycin D高活性菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明属于分子生物学和微生物发酵领域，提供一种Bacillomycin D高活性菌株及其构建方法和应用。该菌株构建方法包括如下步骤：同源臂的扩增、目的基因的扩增、融合片段扩增、线性载体扩增、重组整合质粒获得、转化子获得及检测。本发明利用温敏型质粒pKS2介导的同源重组双交换的方法，将Iturin A合成酶操纵子中的硫酯酶结构域IA‑TE替换至Bacillomycin D合成酶系中，获得高活性菌株fmbJ‑IA‑TE，Bacillomycin D产量为野生菌株的1.31倍，对黄曲霉菌的抑制效果也优于野生菌株。

技术领域

本发明属于分子生物学和微生物发酵领域，具体涉及一种Bacillomycin D高活性菌株及其构建方法和应用。

背景技术

Bacillomycin D是由解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)等芽孢杆菌属微生物合成的一类次级代谢产物，是抗菌脂肽Iturins家族的重要成员。BacillomycinD属于非核糖体肽，其合成途径为聚酮体合成酶系和非核糖体肽合成酶系杂合途径，其合成酶操纵子由4个ORFs构成，分别为bamD、bamA、bamB和bamC，编码BamD、BamA、BamB和BamC亚基。BamC亚基C末端含有一个硫酯酶结构域(Thioesterase，TE)，属于ɑ/β水解酶家族，能断裂肽基载体蛋白(PCP)和酰基分子之间的共价硫脂键，负责环脂肽中间体的环化和水解。此外TE结构域还具有寡聚化、差向异构化等其他功能。近年来，硫酯酶结构域的区域特异性、化学特异性和立体特异性被广泛研究，研究者已经阐明了多种硫酯酶的蛋白晶体结构与作用机理，有望可通过酶催化结合化学合成获得特定的产物。

Bacillomycin D由亲油的β-氨基脂肪酸链(C_14-C17)和亲水的肽链(Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu-Ser-Thr)构成，两部分通过苏氨酰-β-氨基键连接成环。Bacillomycin D具有两亲性，能有效抑制黄曲霉菌、赭曲霉菌等病原真菌，破坏其脂质双分子层，导致细胞膜的通透性、流动性和完整性发生变化，从而使细胞质成分外泄，最终导致细胞死亡。因此未来有潜力将Bacillomycin D开发成高效的食品防腐剂，应用于食品和粮食安全，然而野生菌株合成Bacillomycin D的能力有限，产量难以达到工业化要求。

因此需要寻找更加有效的提高Bacillomycin D产量的菌株。

发明内容

为了克服野生菌株成Bacillomycin D的能力有限的问题，本发明提供一种Bacillomycin D高活性菌株及其构建方法和应用。本发明获得的产Bacillomycin D的高活性菌株，产量为野生菌株的1.31倍。

本发明目的通过如下手段获得：

第一方面，本发明保护一种重组质粒pKS2-IA-TE，包含解淀粉芽孢杆中IturinA合成酶操纵子硫酯酶(TE)基因。

优选的，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LZ-5。

其中，所述重组质粒pKS2-IA-TE的构建方法如下：

(1)设计引物对IA-U-F和IA-U-R、IA-D-F和IA-D-R、IA-TE-F和IA-TE-R；以解淀粉芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板，PCR扩增上游同源臂IA-U、下游同源臂IA-D；以解淀粉芽孢杆菌LZ-5基因组DNA为模板，PCR扩增Iturin A合成酶操纵子中的硫酯酶结构域IA-TE；

(2)以IA-U-F和IA-TE-R为引物，上述(1)中获得的IA-U和IA-TE为模板，通过重叠延伸PCR获得融合片段IA-U-TE；

(3)以IA-U-F和IA-D-R为引物，上述(1)中获得的IA-D和(2)中获得的IA-U-TE为模板，再次重叠延伸PCR获得融合片段IA-U-TE-D；