[发明专利]一种基于KASP技术的丝羽乌骨鸡玫瑰冠分子标记及其应用

权利要求书

1.一种鉴定丝羽乌骨鸡玫瑰冠基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测丝羽乌骨鸡的基因组DNA；

(2)利用检测与丝羽乌骨鸡玫瑰冠相关的分子标记的KASP引物组进行PCR扩增，获取扩增产物；

(3)根据扩增产物的荧光信号鉴定待测丝羽乌骨鸡的玫瑰冠基因型；

在步骤(2)中，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，SEQ ID NO：1所示序列第201bp处有一个G/T碱基突变；

所述KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的第二正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物；所述第一正向引物和所述第二正向引物5’端连接不同颜色的荧光基团；

所述第一正向引物连接HEX荧光基团，所述第二正向引物连接FAM荧光基团；

在步骤(3)中，若荧光信号为HEX，则所述扩增产物的分子标记是TT类型，鉴定待测丝羽乌骨鸡的玫瑰冠基因型为玫瑰冠纯合子RR；若为FAM和HEX，则所述扩增产物的分子标记是TG类型，鉴定为鸡玫瑰冠杂合子Rr，若为FAM，则所述扩增产物的分子标记是GG类型，鉴定为单冠纯合子rr。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包括：模板DNA2μL，引物混合液KASP Assay mix 0.14μL，2×KASP Master mix 5μL，ddH₂O 2.86μL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述引物混合液KASP Assay mix中第一正向引物、第二正向引物和反向引物的体积比为1：1：2。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：预变性94℃15min；变性94℃20s，Touch-down退火并延伸61℃～55℃60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；变性94℃20s，退火并延伸55℃60s，26个循环。

5.一种权利要求1中所述的KASP引物组在鉴定丝羽乌骨鸡玫瑰冠基因型中的应用，其特征在于，利用所述KASP引物组检测待测丝羽乌骨鸡基因组在权利要求1中所述分子标记类型，若是TT类型，鉴定待测丝羽乌骨鸡的玫瑰冠基因型为玫瑰冠纯合子RR；若是TG类型，鉴定待测丝羽乌骨鸡的玫瑰冠基因型为鸡玫瑰冠杂合子Rr，若是GG类型，鉴定待测丝羽乌骨鸡的玫瑰冠基因型为单冠纯合子rr。