[发明专利]一种制备沙门菌外膜囊泡的方法及其应用

说明书

本发明提供一种制备沙门菌外膜囊泡的方法及其应用，属于生物技术领域。该方法包括构建和培养突变株的沙门菌。本发明还提供所述方法制备的沙门菌外膜囊泡在制备疫苗和疫苗增强剂中的应用。采用本发明方法，沙门菌外膜囊泡的产量较原始菌株在LB培养基中表达量提高了约100倍，显著降低了生产成本。采用本发明制备的沙门菌外膜囊泡，具有良好的免疫增强功能，可以添加到疫苗中，能够显著增强免疫效果。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备沙门菌外膜囊泡的方法及其应用。

背景技术

志贺氏菌属(Shigella spp.)细菌是一类具有高度传染性以及致病性，并且会引起人类严重腹泻甚至死亡的革兰氏阴性菌，俗称痢疾杆菌。痢疾是一种全世界范围内高发的肠道传染病，据保守估计，全世界每年的感染人数超过1.6亿，死亡人数超过110万人。

随着抗生素耐药性问题越来越严重，疫苗防治细菌感染已然成为趋势。尽管现阶段没有找到一种令人满意的痢疾疫苗，但研究已经发现了一些具有潜力的候选疫苗靶标，其中志贺氏菌的脂多糖(Lipopolysaccharide) 能够表现较好的保护力，有研究证明志贺氏菌脂多糖与蛋白的复合体能够激发小鼠很高的血清抗体滴度，并且能够表现一定的保护力，临床实验表明，福氏2a(Shigella flexneri 2a)的O抗原多糖能够引起特异的免疫保护，但脂多糖最关键的问题在于进入宿主体内，不能有效的到达宿主免疫系统被免疫系统识别，从而有一定概率导致免疫失败。若能解决该问题，脂多糖有潜力发展成为一种高效的疫苗靶标。脂多糖是大多数革兰氏阴性菌主要的毒力因子，也是细菌外膜的重要组成成分，由O-抗原(O antigen)、核心多糖(core polysaccharide)以及内脂A(lipid A)组成。通过对沙门菌以及志贺氏菌的脂多糖合成基因簇比较可以发现，其O抗原基因簇在结构上略有不同，但O抗原合成结合于核心多糖位点上所用的酶均为RfaL，在沙门菌外膜上合成志贺氏菌的O抗原，并在合成途径中结合于沙门菌的核心寡糖上成为可能。有研究利用类似的策略在肠炎沙门菌中表达了大肠杆菌O78的O抗原基因簇，并且通过动物实验表明通过沙门菌递呈的O抗原能够刺激机体产生特异性的免疫反应。

沙门菌外膜囊泡已经被证明是一种高效的递呈载体，并且有研究证明通过沙门菌外膜囊泡递呈的PspA蛋白能够刺激宿主产生较好的免疫反应，并且提供一定的保护力。外膜囊泡由于其脂质双分子层的特性可以包裹递呈抗原不被机体过快清除，同时能够刺激机体引起免疫保护性反应并且避免减毒活疫苗以及灭活疫苗的安全风险，并将蛋白递呈至宿主深处从而更好的刺激机体产生免疫保护，因此外膜囊泡可以作为一种高效的抗原递呈载体。理想的外膜囊泡递呈载体应该具有以下特性：1)外膜囊泡载体本身能够刺激宿主产生良好的免疫保护反应，但尽可能的避免无意义的免疫反应干扰所递呈的外源抗原；2)尽可能的简化外膜囊泡的纯化步骤，并尽可能的产生大量的外膜囊泡可以降低生产成本；3)载体本身可以作为佐剂协助所递呈的抗原被宿主免疫系统所识别，从而发挥更大的功效。

外膜囊泡疫苗由于其有诸多不可比拟的优势，已经成为多种致病菌疫苗研究的热点。但现阶段大多数致病菌外膜囊泡疫苗更多的只是停留在对其野生型菌株的外膜囊泡进行评估，而对外膜囊泡作为疫苗载体也更多的是停留在无毒性的大肠杆菌工程菌上进行研究。外膜囊泡疫苗在全世界范围内正处于上升期的研究热点，而在国内，这方面研究几乎一片空白。若能够成功开发出基于外膜囊泡的疫苗递呈平台，无论是在基础研究还是在转化应用方面均具有巨大的前景。。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的之一是提供一种提高细菌外膜囊泡产量的方法，能够显著提高细菌外膜囊泡产量。

本发明的再一目的是提供所述方法制备的细菌外膜囊泡在制备疫苗和免疫增强剂中的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

提供一种制备沙门菌外膜囊泡的方法，包括以下步骤：