[发明专利]一种筛选鉴定与植物多亚基SCF E3连接酶协同工作E2的方法在审
| 申请号： | 202210697749.0 | 申请日： | 2022-06-20 |
| 公开（公告）号： | CN114908138A | 公开（公告）日： | 2022-08-16 |
| 发明（设计）人： | 李家洋;王冰;刘会会;余泓;孟祥兵;刘贵富;陈明江;荆彦辉 | 申请（专利权）人： | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/25 | 分类号： | C12Q1/25;C12N9/00;C12N15/82;G01N33/573 |
| 代理公司： | 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 | 代理人： | 张立娜 |
| 地址： | 100101 北*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 筛选 鉴定 植物 多亚基 scf e3 连接酶 协同 工作 e2 方法 | ||
1.一种鉴定待测泛素结合酶E2能否与植物多亚基SCF E3连接酶协同工作形成多聚泛素链的方法，包括如下步骤：
(A1)配制反应体系；所述反应体系中含有待测泛素结合酶E2、植物多亚基SCF E3连接酶、泛素活化酶E1和泛素蛋白Ubiquitin；
(A2)将(A1)配制好的反应体系置于22-37℃震荡反应1-2h；
(A3)对(A2)反应后的体系进行检测，从而确定所述待测泛素结合酶E2能否与所述植物多亚基SCF E3连接酶协同工作形成多聚泛素链。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应体系中还含有反应缓冲液；所述反应缓冲液中含有Tris、MgCl2、ATP、DTT。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述反应体系组成如下：50mM Tris(pH7.4),10mM MgCl2,5mM ATP,2mM DTT,1.67mg/L泛素活化酶E1,6.67mg/L所述待测泛素结合酶E2,66.67mg/L泛素蛋白Ubiquitin，6.67mg/L所述植物多亚基SCF E3连接酶；所述植物多亚基SCF E3连接酶的含量是以其中F-box蛋白的量计算的；和/或
所述反应体系中各个组份的加样顺序为：所述待测泛素结合酶E2、所述植物多亚基SCFE3连接酶、泛素蛋白Ubiquitin、泛素活化酶E1、所述反应缓冲液。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述(A2)中，反应温度为28℃；和/或，震荡条件为950rpm；和/或，反应时间为2h。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述植物多亚基SCF E3连接酶按照包括如下步骤的方法制备得到：
(B1)将所述植物多亚基SCF E3连接酶复合物中的F-box蛋白的编码基因融合蛋白标签编码序列后导入受体植物，得到转基因植物；
(B2)取(B1)所得转基因植物的组织，在液氮中进行研磨；
(B3)从(B2)所得研磨粉末中提取总蛋白；
(B4)利用能够特异性结合所述蛋白标签的物质从(B3)所得总蛋白中分离得到的蛋白复合物即为所述植物多亚基SCF E3连接酶。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述植物多亚基SCF E3连接酶为水稻独脚金内酯信号途径中的SCFD3E3连接酶或者水稻赤霉素信号途径中的SCFGID2E3连接酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：当所述植物多亚基SCF E3连接酶为所述SCFD3E3连接酶时，所述F-box蛋白为D3蛋白；
或
当所述植物多亚基SCF E3连接酶为所述SCFGID2E3连接酶，所述F-box蛋白为GID2蛋白。
8.一种植物多亚基SCF E3连接酶的制备方法，包括权利要求5-7任一中的步骤(B1)-(B4)。
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