[发明专利]一种筛选鉴定与植物多亚基SCF E3连接酶协同工作E2的方法

说明书

本发明公开了一种筛选鉴定与植物多亚基SCF E3连接酶协同工作E2的方法。本发明提供了一种鉴定待测泛素结合酶E2能否与植物多亚基SCF E3连接酶协同工作形成多聚泛素链，包括：配制反应体系，含有待测泛素结合酶E2、植物多亚基SCF E3连接酶、泛素活化酶E1和泛素蛋白Ubiquitin；将反应体系置于22‑37℃震荡反应1‑2h；检测，从而确定所述待测泛素结合酶E2是否能够与所述植物多亚基SCF E3连接酶协同工作形成多聚泛素链。本发明对于解析植物多亚基SCF E3连接酶的功能至关重要。本发明具有重要的理论及应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种筛选鉴定与植物多亚基SCF E3连接酶协同工作E2的方法。

背景技术

蛋白质的降解和合成之间的平衡，对于维持细胞内稳态及机体的正常功能具有重要作用。在真核细胞中，泛素-蛋白酶体途径是蛋白降解的最主要途径之一，该途径由底物蛋白的泛素化修饰过程和蛋白酶体依赖的降解过程组成。蛋白泛素化修饰过程需要泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)协同完成。其中，SCF E3连接酶是最大的泛素连接酶亚家族之一，是由SKP1、Cullin1、RBX1和可置换的F-box蛋白组成。

体外泛素化分析体系为研究E3连接酶分子作用机理提供了有效的方法平台。目前为止，有关植物多亚基SCF E3连接酶体外活性重组体系的研究仍旧空白，筛选鉴定与多亚基SCF E3连接酶协同工作的E2是建立该体外重组体系的瓶颈之一。因此，建立一个筛选鉴定与植物多亚基SCF E3连接酶协同工作E2的方法平台，对于推进植物多亚基E3连接酶分子作用机理的研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选鉴定与植物多亚基SCF E3连接酶协同工作E2的方法，并且提供一些具体的泛素结合酶E2，以及筛选鉴定待测蛋白是否具有泛素结合酶活性的方法。

第一方面，本发明要求保护一种鉴定待测泛素结合酶E2是否能够与植物多亚基SCF E3连接酶协同工作形成多聚泛素链的方法。

本发明要求保护的鉴定待测泛素结合酶E2能否与植物多亚基SCF E3连接酶协同工作形成多聚泛素链的方法，可包括如下步骤：

(A1)配制反应体系；所述反应体系中含有待测泛素结合酶E2、植物多亚基SCF E3连接酶、泛素活化酶E1和泛素蛋白Ubiquitin；(A2)将(A1)配制好的反应体系置于22-37℃震荡反应1-2h(如2h)；

(A3)对(A2)反应后的体系进行检测，从而确定所述待测泛素结合酶E2能否与所述植物多亚基SCF E3连接酶协同工作形成多聚泛素链。

进一步地，所述反应体系中还含有反应缓冲液(记为反应缓冲液1)；所述反应缓冲液1中Tris(如pH 7.4)、MgCl₂、ATP、DTT。

在一些案例中，所述反应体系组成如下：50mM Tris(pH 7.4),10mM MgCl₂,5mMATP,2mM DTT,1.67mg/L泛素活化酶E1,6.67mg/L所述待测泛素结合酶E2,66.67mg/L泛素蛋白Ubiquitin，6.67mg/L所述植物多亚基SCF E3连接酶(依据F-box蛋白进行定量计算)。上述各物质的浓度为在反应体系中的终浓度。

进一步地，所述反应体系中各个组份的加样顺序最好为：所述待测泛素结合酶E2、所述植物多亚基SCF E3连接酶、泛素蛋白Ubiquitin、泛素活化酶E1、所述反应缓冲液1(如可为20×母液，配方：1M Tris(pH 7.4),200mM MgCl₂,100mM ATP,40mM DTT)。

在一些案例中，所述(A2)中，反应温度为28℃；震荡条件为950rpm；反应时间为2h。950rpm的转速条件能保证SCF E3连接酶复合体能均匀地与体系中的其他成分接触混合并进行活性反应。