[发明专利]一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法

权利要求书

1.一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法，其特征在于，所述高密度发酵方法至少包括以下步骤：

S1、构建重组EK酶工程菌，包括：

合成表达包含EK酶的重组融合蛋白的表达框序列，所述表达框序列如SEQ ID No.4所示，将所述表达框序列插入到表达载体上，构建得到重组表达载体，并将所述重组表达载体导入到大肠杆菌中，得到所述重组EK酶工程菌，冻存备用；

S2、菌种活化，得活化种子培养液；

S3、发酵培养：将所述活化种子培养液接种至发酵培养基，发酵过程中，流加补料培养基；

所述补料培养基的组成为：质量体积百分比含量分别为50% ~ 65%的葡萄糖水溶液和15% ~ 25%的酵母浸粉水溶液，按照体积比1：3 ~ 4混合；

S4、诱导表达：当OD 600值为145 ~ 150时，添加IPTG诱导EK酶的表达，至OD600值出现平台期发酵结束。

2.根据权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征在于，在步骤S1中，所述表达框序列插入到pET-30a（+）的NdeI和XhoI酶切位点之间。

3.根据权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征在于，在S2中，所述菌种活化包括以下步骤：

一级活化：取冻存的所述重组EK酶工程菌，按照1：800 ~ 1200的体积比，接种至活化培养基，35 ~ 38℃，200 ~ 240 rpm，培养12 ~ 16小时，至菌种OD600值为4.0 ~ 8.0，得一级活化种子液；

二级活化：将所述一级活化种子液按照1：4 ~ 6的体积比接种至活化培养基，35 ~ 38℃，200 ~ 240 rpm，培养2 ~ 5小时，至菌种OD600值为3.0 ~ 4.0，得二级活化种子培养液。

4.根据权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征在于，在S3中，将所述S2中活化种子培养液按照1：5 ~ 15的体积比接种至发酵培养基；发酵条件为：温度36 ~ 38℃，空气的通气量450 ~ 550 mL/min，氧气的通气量0 ~ 300 mL/min，转速300 ~ 1400 rpm；并通过对空气通气量、氧气通气量和转速调整，将溶氧控制在15% ~ 30%；发酵开始后，pH伴随溶氧同时开始上升时开始流加补料培养基，所述流加补料培养基的时间为10 ~ 12小时。

5.根据权利要求4所述的高密度发酵方法，其特征在于，在S3中，通过流加补料培养基控制发酵液的OD600值每小时增加7 ~ 12。

6.根据权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征在于，所述诱导的温度为27 ~ 33℃，IPTG终浓度为0.9 ~ 1.1 mmol。

7.根据权利要求3所述的高密度发酵方法，其特征在于，所述活化培养基的组成为：胰蛋白胨16 ~ 22 g/L、酵母浸粉8 ~ 14 g/L、氯化钠8 ~ 12 g/L，余量为水。

8.根据权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：

酵母浸粉 8 ~ 12 g/L；

一水合柠檬酸 0.8 ~ 1.2 g/L；

硫酸铵 4 ~ 6 g/L；

磷酸二氢钾 5 ~ 7 g/L；

七水合硫酸亚铁0.04 ~ 0.05 g/L

无水氯化钙 0.001 ~ 0.003 g/L

葡萄糖 9.5 ~ 11.5 g/L；

硫酸镁 11 ~ 13 g/L；

溶液D 900 ~ 1100 μL/L；

消泡剂 50 ~ 150 μL/L；

溶液D的组成为：

七水合硫酸亚铁 3.3 ~ 3.4 g/L；

七水合硫酸锌 0.8 ~ 0.9g/L；

一水合硫酸锰 0.5 ~ 0.55 g/L；

四水合钼酸铵 0.16 ~ 0.2 g/L；

五水合硫酸铜（II） 0.1 ~ 0.15 g/L；

磷酸 45 ~ 50 mL/L；

所述发酵培养基使用氢氧化钠溶液调节pH至6.7 ~ 7.0。