[发明专利]一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法

说明书

本发明涉及生物发酵工程技术领域，尤其涉及一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法，具体包括：合成表达包含EK酶的重组融合蛋白的表达框序列，表达框序列如SEQ ID No.4所示，构建重组EK酶工程菌，菌种活化，高密度发酵培养，诱导表达EK酶。本发明的重组EK酶工程菌的高密度发酵方法，表达量可提高至19g/L以上，同时可显著降低包涵体蛋白的色素含量。

技术领域

本发明涉及生物发酵工程技术领域，尤其涉及一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法。

背景技术

丝氨酸蛋白酶肠激酶（enterokinase）（简称肠激酶或EK酶），也被称为肠肽酶（enteropeptidase），是异源二聚体丝氨酸蛋白酶，一种催化胰蛋白酶原转变为活性胰蛋白酶的哺乳动物酶。肠激酶优先选择底物序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（DDDDK），并选择性地在赖氨酸之后切割。由于肠激酶的轻链结构在人、牛和猪中保守，其识底物别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在脊椎动物中也有很强的保守性，且几乎所有被定序的胰蛋白酶原都具有作用于4个天冬酰胺相连识别序列的特征，而此序列在其他的天然蛋白质上又非常罕见。肠激酶由1条结构亚基（重链）和1条催化亚基（轻链）构成，两者通过1个分子间二硫键结合，结构亚基负责将催化亚基固定在小肠刷状缘膜上并引导它向肠腔移动，催化亚基可以特异性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下，将胰蛋白酶原活化为胰蛋白酶，从而启动各种酶原活化的级联。

对于外源基因的表达可以采用原核表达和真核表达系统进行，但真核表达系统在表达目的蛋白时存在一些缺陷。原核表达系统方面，大肠杆菌表达系统是研究最为深入，发展最迅速的表达系统，其遗传学背景、基因表达调控机理清晰，表达载体及宿主菌种类繁多，常被用于多肽和蛋白质的表达，是目前首选的外源表达系统。对于应用原核系统表达外源基因时，大多研究利用融合蛋白表达方式，将各种不同的引导肽序列融合到目的基因上，形成重组融合蛋白。在大肠杆菌中表达时，引导肽可以将目的蛋白分泌到细胞周质甚至细胞外，最后，通过蛋白酶等将引导肽切除去。在大肠杆菌（E.coli）中，许多哺乳动物蛋白被表达为融合蛋白，其必须被切割以释放成熟的活性蛋白。为了实现该目的，就需要有使用工具酶，优选直接在连接处切割而在产物上不留下额外氨基酸的工具酶。由于肠激酶的底物酶切位点序列具有上述高度的特异性，使得其成为基因工程融合蛋白表达后修饰过程中一个极其有用的工具酶而被广泛应用。

高密度培养一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。现代高密度培养技术在用基因工程菌（尤其是大肠埃希氏菌）生产多肽类药物的实践中逐步发展。大肠埃希氏菌在生产各种多肽类药物中具有极其重要的地位。若能提高菌体培养密度，提高产物的比生产速率（单位体积单位时间内产物的产量），不仅可减少培养容器的体积、培养基的消耗和提高下游工程中分离、提取的效率，而且还可缩短生产周期、减少设备投入和降低生产成本。

但由于肠激酶自身氨基酸序列和结构特点，对于目前广泛应用的大肠杆菌表达系统获得的重组工程菌，其包涵体存在着蛋白表达量低、包涵体产物复性困难等的问题。因此，仍需要奖励能够更优的适应大肠杆菌的EK酶表达系统，构建具备更高的分泌表达和活性收率的重组肠激酶工程菌。

而且，在发酵方面，受制于现有发酵体系构建工程菌的表达效率低，材料损耗大，使产品的产量难以提升，同时伴随着产酶的成本居高不下。因此，开发一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法具有重大意义，以便于工业化生产EK酶。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法。

为了获得改善的EK蛋白的体外复性效率，提高EK蛋白的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升，本发明提出了一种突变的牛肠激酶，其相比现有商业化酶具备更优的酶活，且活性蛋白的收率可提高4倍以上。在此基础上，进一步获得了可以高效表达该牛肠激酶的重组EK酶工程菌。为了进一步提高产酶量，本发明进一步提出了该重组EK酶工程菌的高密度发酵方法，至少包括以下步骤：