[发明专利]用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法

权利要求书

1.一种用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法，其特征在于，其特征在于，包括选择检测的组织类型、检测项目及内容、判断标准；

组织类型：胎盘组织；

检测项目及内容：对胎盘组织中的mRNA进行提取，进行MAGEL2基因的PCR检测；所述PCR检测过程还包括引入内参基因ACTB，选择扩增片段，设定与MAGEL2基因扩增产物相近的Tm值；

判断标准：

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果：若内参基因ACTB有扩增条带，同时MAGEL2有扩增条带，则间接证明染色体15q11.2-q13印记区域有表达；若内参基因ACTB有扩增条带，同时MAGEL2无扩增条带，则间接证明染色体15q11.2-q13印记区域无表达。

2.根据权利要求1所述的用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法，其特征在于，内参基因引物序列：

序列(5'-3')

上游引物：CATGTACGTTGCTATCCAGGC

引物长度：21bp

模板起始位置：477

模板终止位置：497

Tm：59.13℃

GC：52.38％

下游引物：CTCCTTAATGTCACGCACGAT

引物长度：21bp

模板起始位置：706

模板终止位置：726

Tm：58.46℃

GC：47.62％

目标产物

NM_001101.5Homo sapiens actin beta(ACTB),mRNA

产物长度＝250bp。

3.根据权利要求1所述的用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法，其特征在于，MAGEL2基因引物序列：

序列(5'-3')

上游引物：CCTGGGCTCCGCTAAATCATT

引物长度：21bp

模板起始位置：2246

模板终止位置：2266

Tm：60.48℃

GC：52.38％

下游引物：TCATGCGGTCTTTTGAAGGGG

引物长度：21bp

模板起始位置：2356

模板终止位置：2376

Tm：60.89℃

GC：52.38％

目标产物

NM_019066.5Homo sapiens MAGE family member L2(MAGEL2),mRNA

产物长度＝131bp。

4.根据权利要求1所述的用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系及反应条件如下：

反应体系：

将cDNA模板1-4μl，引物0.5-2μl，dNTP 0.5-2μl，10xPCR缓冲液2.5-10μl，MgCl₂溶液2.0-8μl，Taq DNA聚合酶1-4U混合，加水补足至25-100μl；其中，cDNA模板浓度为20-1000ng/μl，引物浓度为5μM，dNTP浓度为10mM，MgCl₂溶液浓度为25mmol/L；

反应条件：

95℃起始变性4min；95℃变性40sec，58-61℃退火40sec，72℃延伸40sec，35个循环；72℃延伸10min。