[发明专利]一种提高东方百合‘西伯利亚’遗传转化效率的方法

权利要求书

1.一种提高东方百合‘西伯利亚’遗传转化效率的方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：

步骤1，胚性愈伤组织的诱导和保存

将旺盛生长阶段的百合组培苗的小鳞片切成0.5 cm²大小，接种在培养基MS+2.0 mg/LPIC+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂中暗培养，培养温度为25±1℃，相对湿度为80-90%，直至形成黄绿色颗粒状明显的愈伤组织；33天转接一次，每次转接时，将愈伤组织与外植体分离并切去褐化部分，在20℃完全黑暗条件下培养；

步骤2， 农杆菌侵染液的制备

挑取携带植物表达载体的农杆菌EHA105单菌落，接种于包含50 mg/L Kan和50 mg·L^-1Rif的YEB液体培养基中振荡培养至OD₆₀₀为0.6，5000 rpm离心10 min，收集菌体；取50 mL含3μM CX的MS液体培养基重悬菌体后，200 rpm重悬液振荡2 h，即为侵染液；

步骤3， 农杆菌侵染和共培养

切取淡黄色在25℃条件下培养10-15天的体细胞胚，扎孔造伤后投入农杆菌侵染液中；轻轻晃动培养瓶使愈伤组织与侵染液充分接触10min后取出，迅速吸干组织块表面的残留菌液，转移至共培养培养基MS + 2.0 mg/L PIC+3μM CX+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂中暗培养，培养温度为20±1℃；

步骤4，抗性愈伤组织的筛选

共培养48h后，将愈伤组织转移至MS + 2.0 mg/L PIC + 400 mg/L Cef +150 mg/LKan+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂培养基中筛选脱菌2周后，转接到相同培养基中继续筛选脱菌培养15d转接一次；每次转接均切除愈伤组织块的褐化部分；

步骤5， 抗性愈伤组织再生

抗性筛选8周以上，愈伤组织褐化、坏死现象逐渐减轻；将健康的黄色抗性愈伤组织转入萌发培养基MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.88g/L CaCl₂ + 30 g/L蔗糖 + 7 g/L琼脂培养基中，光下培养，每天16h光照/8h黑暗，光照强度36 μmol·m^-2·s^-1，培养温度为25±1℃；6周后，愈伤组织经体细胞胚发生途径再生成为完整的转化植株。

2.根据权利要求1所述的提高东方百合‘西伯利亚’遗传转化效率的方法，所述步骤2和步骤 3在侵染液和共培养培养基中，添加3μM 羟敌草腈用于提高‘西伯利亚’百合体细胞胚的分化。